左旋芳樟醇和β-石竹烯对鸡血管内皮细胞炎性损伤的影响

廖加美，蔡亚玲，彭俊超，王万林，高月，易琼，王鲁*

(1 贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025；
2 西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025)

血管内皮细胞(VECs) 作为血管腔内的一层特化细胞，排列在血管和淋巴管的内表面，不仅能形成血管屏障，还能调节血管舒缩张力、凝血和血管通透性等[1]，此外，VECs是一种有效的免疫调节细胞，可以控制白细胞的迁移，促进或阻碍免疫反应[2]。因此，在各种传染病在内的多种病理状态的发病机制中，内皮细胞功能障碍(ECD)起着中心作用[3]。一般来说，微生物病原体可以通过直接靶向和损伤内皮细胞，或者通过诱导细胞因子反应而导致血管内皮细胞激活不受控制，从而导致ECD[4]。病原体诱发的ECD的病理后果通常是严重的，可能包括血管屏障破坏、水肿、血栓形成、消耗性凝血病、出血、先天性免疫反应异常和大量炎性细胞募集[5]，这些与ECD相关的病理模式是一些最致命的微生物疾病的标志，包括病毒性出血热，甲型流感病毒引起的急性呼吸窘迫综合症，恶性疟原虫疟疾和细菌性败血症[6]。值得注意的是，鸡高致病性禽流感病毒感染也与ECD有关。目前，关于VECs作为禽病原体靶点的作用及其在鸡传染性疾病发病机制中的作用还知之甚少。因此，本文使用LPS诱导鸡血管内皮细胞(chPAEC)炎症模型，来进一步研究禽类VECs相关的炎症机制。

LPS是革兰氏阴性菌崩解时被释放出来的一种内毒素，内毒素与细胞膜上的CD14结合激活TLR4[7]，诱导VEC内ICAM-1和VCAM-1 的mRNA水平增加，提高 ICAM-1、VCAM-1、IL-6 和 TNF-α的表达，增强 NF-κB活化，使NF-κB转入细胞核，造成TNF-α、IL-6和NO的大量释放[8]，最终造成了炎性因子风爆，引起一系列病理生理变化。TLR4/NF-κB信号通路在血管内皮损伤过程中扮演了重要的角色，下调该通路可起到对血管内皮细胞的保护作用[9]。因此，有效干预 TLR4/NF-κB 信号通路对减轻血管内皮细胞炎症导致的血管损伤有极其重要的意义。

在前期研究中发现艾纳香油抗炎活性与左旋芳樟醇((-)-Linalool)和β-石竹烯(BCP)有关[10]。现代研究表明(-) -Linalool能有效抑制LPS诱导巨噬细胞以及巴斯德菌介导的肺炎中炎症因子的表达，抑制NF-κB信号通路激活，增加转录因子Nrf2信号通路[11]，BCP可抑制血清及组织中的炎症因子及干扰素γ的mRNA水平，抑制PI3K/AKT/mTOR途径和ROS介导的MAPKs活化来抑制生长并诱导凋亡[12]，而(-)-Linalool和BCP在chPAEC抗炎作用的研究目前还未报道。因此，本文对(-) -Linalool和BCP对chPAEC抗炎方面进行研究，为艾纳香油及其(-)-Linalool和BCP应用于家禽炎症性疾病的防治提供理论参考。

1.1 试验材料

(-) -Linalool和BCP，均购买于上海优宁维科技公司(Absin)；
chPAEC，购买于北纳创联生物科技有限公司；
EA.hy926细胞，购买于昆明细胞库；
1640培养基、胎牛血清、双抗，美国Gibco公司；
脂多糖(型号:O111:B4)，美国Sigma公司；
细胞RNA提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；
FastQμant cDNA第一链合成试剂盒和2×RealStar Green Fast Mixture，购买于GenStar公司；
0.25 %胰蛋白酶、MTT、吐温-80、PBS，北京索莱宝科技有限公司；
一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素E2(PGE2)、黏附分子(ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)、环氧合酶-2(COX-2)检测试剂盒武汉基因美生物科技有限公司；
细胞蛋白提取试剂购于美国CST生物技术公司；
蛋白浓度测定试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；
兔抗鸡NF-κBp65一抗，购于Proteintech公司；
一抗鼠抗鸡(CD34和β-actin)和二抗(FITC*羊抗鼠IgG、HRP*羊抗兔IgG和HRP*羊抗鼠IgG)，都均购自ImmunoWay Biotechnology Company。其他等试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 chPAEC培养及鉴定

chPAEC采用含100U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素及10% 胎牛血清的1640培养基培养，于 37 ℃、5% CO2培养箱中孵育每24 h换液，待细胞生长至70%～90% 时，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 chPAEC细胞的鉴定

(1)PCR扩增法:应用 TIANamp Genomic DNA Kit (TIAN GEM公司) (硅胶-离心柱型)进行细胞基因组DNA的提取纯化，操作步骤按试剂盒说明书进行。取100 ng的基因组 DNA，作为模板 DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为12 μL:2×DreamTaqTMGreen PCR Master Mix 6 μL，上下游引物各1 μL(见表1)，ddH2O增加至12 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变形30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共30个循环;72 ℃完全延伸 10 min，PCR 扩增完成后，上样量为6 μL，用1.5%凝胶电泳进行检测目的条带，判断细胞的物种来源。

(2)CD34免疫荧光检测：细胞爬片后，PBS 洗涤，用4%的多聚甲醛固定30 min；
PBS 洗涤；
0.1% Triton-100 穿孔2 min，PBS 洗涤,用1%的牛血清白蛋白封闭30 min，加入1%BSA稀释的CD34(1∶500)一抗，4 ℃孵育过夜，PBS 洗涤；
加入1%BSA稀释的FITC*羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)，37 ℃ 避光孵育1 h，PBS 洗涤；
DAPI染色2 min，PBS 洗涤，用抗荧光淬灭封片剂的封片液封片，然后在激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.2.3(-)-Linalool和BCP对chPAEC毒性的测定

将chPAEC以每孔2×105个·mL-1的密度接种96 孔板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h；
待细胞长满后，弃掉孔内培养液，(-) -Linalool和BCP分别用DMSO溶解至20 mg·mL-1，-20 ℃保存，给药时均用细胞培养液稀释，加入的终浓度分别为0、100、200、300、400、500 μg·mL-1的溶液，加入培养基使终体积为100 μL。孵育24 h 后，每孔加入20 μL的MTT溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h 终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入 150 μL 二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪 490 nm 处测OD值。

1.2.4 ELISA检测(-)-Linalool和BCP对LPS致chPAEC分泌炎性因子及粘附因子的影响

将chPAEC以每孔2×105个·mL-1的密度接种24 孔板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h；
待细胞长满后，实验设空白对照组(Contr)，LPS组，LPS +药物组，其中空白对照组不含LPS和药物成分，LPS终浓度均为4 μg·mL-1(LPS用PBS溶解至1 mg·mL-1，-20 ℃保存)，药物的终浓度分别为40、80、120 μg·mL-1，分别设3个复孔。给药12 h后取细胞培养液，3 000 r·min-1离心20 min 取上清液，按ELISA试剂盒说明书进行iNOS、PGE2、VCAM-1、ICAM-1、COX-2含量的测定。

1.2.5 qRT-PCR法检测(-)-Linalool和BCP对LPS致chPAEC中炎症因子IL-6和TNF-α及TLR4信号通路相关因子mRNA表达的影响

将chPAEC以每孔2×105个·mL-1的密度接种6 孔板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h；
待细胞长满后，药物处理同1.2.4，给药12 h后弃去培养基，PBS洗2次，根据试剂盒说明提取细胞的RNA。然后按照GenStar 公司的StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover StarScript II cDNA 第一链合成预混试剂(含去基因组)逆转录试剂盒说明书合成cDNA，进行荧光定量PCR反应，引物序列见表2，PCR反应参数为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，经40个循环后，65 ℃延伸5 s，95 ℃延伸5 s，采集样品信息。以GAPDH作为内部标准化参照，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

表2 引物序列及退火温度

1.2.6 Western-blot检测(-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC中NF-κBp65的影响

将chPAEC以 2×105个·mL-1的密度接种于六孔板中，37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，药物处理同1.2.3，给药12 h后，吸弃培养基，用 PBS 洗涤2次，加入适量的RIPA 裂解液(使用前以1∶100的比例加入PMSF)，冰上裂解 15 min，然后4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，电泳60 min后转膜。膜用含5%脱脂奶粉的 1×TBST 室温封闭1.5 h，抗体均用5%脱脂奶粉稀释，加入稀释后的NF-κBp65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000) 一抗，4 ℃孵育过夜，用 1×TBST洗膜 3 次，每次6 min，然后分别用HRP*羊抗兔IgG和HRP*羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000) 室温孵育1 h，用1×TBST洗膜3次，每次6 min，发光试剂显色2 min，后进行压片显影。以β-actin为内参检测NF-κBp65目的蛋白的表达量。

1.2.7 统计学处理

2.1 chPAEC的鉴定

不同种属来源的2种细胞进行特异性验证，见图1A。

由电泳结果可知，各引物仅对同源物种的细胞扩增出目的条带，Mitochondrial DNA基因在chPAEC和鸡全血泳道都在197pb出现了清晰条带，β-globin基因在EA.hy926细胞泳道1 411 pb出现了清晰条带，而对其他种属细胞的DNA 模板无扩增条带；
VECs特有CD34 抗原，进行CD34抗体及FITC*羊抗鼠IgG免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察，细胞核呈蓝色，其胞浆呈特征性绿色荧光，见图1B。

图1 chPAEC的鉴定结果

2.2 (-)-Linalool和BCP对chPAEC的毒性作用

运用MTT法来检测(-)-Linalool和BCP对chPAEC的毒性作用，结果如图2所示，与未加(-)-Linalool和BCP处理的空白对照组相比，用不同浓度的(-)-Linalool和BCP作用细胞24 h后，对细胞活力无明显影响(P> 0.05)，因此浓度在500 μg·mL-1内均可用于后续实验。

图2 (-)-Linalool和BCP 对chPAEC毒性的影响

2.3 (-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC中炎症因子IL-6和TNF-a及TLR4信号通路相关因子mRNA表达的影响

利用qRT-PCR法检测(-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC细胞分泌IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA的影响。结果如图3所示，与空白对照组相比，LPS均能使IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA表达显著升高(P<0.05)，与LPS组相比，(-)-Linalool的低、中、高剂量均能使IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA显著或极显著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖性；
而BCP的中、高剂量组能使IL-6和TNF-α mRNA分泌量显著或极显著降低(P<0.05，P<0.01)，对CD14、TLR4和MyD88 mRNA表达低剂量就能极显著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖性。从图中可知，在同一剂量条件下，(-)-Linalool的作用会更佳。

2.4 (-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC炎性因子PGE2、COX-2和iNOS及黏附因子VCAM-1和ICAM-1的影响

采用ELISA法检测(-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC分泌PGE2、COX-2、iNOS、VCAM-1和ICAM-1的影响。结果如图4所示，与空白对照组相比，LPS均能使PGE2、COX-2、iNOS、VCAM-1和ICAM-1分泌量极显著升高(P<0.01)；
与LPS组相比，(-)-Linalool中、高剂量组能使PGE2、COX-2、VCAM-1分泌量显著或极显著降低(P<0.05，P<0.01)，对iNOS分泌量低剂量就能显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，对ICAM-1高剂量才能极显著降低(P<0.01)；
而BCP低剂量就能使PGE2、COX-2、iNOS和VCAM-1分泌量显著或极显著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖性，对于ICAM-1中剂量组能使分泌量显著降低(P<0.05)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 与对照组相比；
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与LPS组相比。图3 (-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC分泌的IL-6(A)、TNF-α(B)、CD14(C)、TLR4(D)和MyD88(E) mRNA表达的影响

**P<0.01，***P<0.001 与对照组相比；
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与LPS组相比。图4 (-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC分泌的COX-2(A)、PGE2(B)、iNOS(C)、VCAM-1(D)和ICAM-1(E) 表达的影响

2.5 (-)-Linalool和BCP对 LPS刺激chPAEC中NF-κBp65蛋白的影响

采用Western-blot法检测(-)-Linalool和BCP对 LPS刺激chPAEC中NF-κBp65蛋白的影响，结果如图5所示。

与空白对照组相比，LPS能使NF-κBp65蛋白的表达极显著升高(P<0.001)，与LPS组相比，(-)-Linalool和BCP的低、中、高剂量均能使NF-κBp65蛋白的表达极显著降低(P<0.001)，且呈剂量依赖性。结果表明，(-)-Linalool和BCP能够通过作用于NF-κB通路，抑制炎症因子和黏附因子的释放。

***P<0.001 与对照组相比；
###P<0.001与LPS组相比。图5 (-)-Linalool和BCP对LPS刺激chPAEC中NF-κBp65(A-C)蛋白表达的影响

有研究表明，微血管内皮细胞是内毒素作用的主要靶细胞，通常内毒素直接作用于微血管内皮细胞而产生的损伤效应，另外可与免疫细胞膜上的CD14结合，诱导免疫细胞释放多种细胞因子和炎性介质，最后再影响微血管内皮细胞的通路[13]。LPS是革兰氏阴性菌崩解时被释放出来的一种内毒素，能够诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌TNF-α，会导致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞形态变形、黏附分子及细胞因子增加、大量炎症介质产生、诱导细胞凋亡等病理表现[14]。TLR4激活可以诱导微血管内皮细胞细胞内黏附分子(ICAM-1)和血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1) 的mRNA水平增加，提高 ICAM-1、VCAM-1、IL-6 和 TNF-α的表达，增强 NF-κB活化[15]。NF-κB 是在转录水平上调控COX-2和 iNOS基因表达的关键转录因子。特别是在 LPS 诱导的炎性反应中,NF-κB 起着关键的调控作用[16]。前期研究发现，(-)-Linalool和BCP无论在体内还是体外都具有抗炎作用，而且对LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症介质也具有较好的抑制作用[17]，但是对VECs作用及可能的作用机制还尚未清楚。因此，本文从炎性黏附和炎性因子分泌两方面来评价(-)-Linalool和BCP对血管内皮细胞炎症损伤的保护作用。

为确定细胞来源的可靠性，以及培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染现象，本研究针对不同物种的特异性基因(Mitochondrial DNA[18]和β-globin[19])进行引物设计，建立PCR扩增体系[20]，对2种不同种属来源的细胞 (chPAEC，EA.hy926细胞) 进行种属鉴定，由结果可知，在目标泳道、目标位置出现了清晰可见的条带，Mitochondrial DNA基因在chPAEC和鸡全血泳道都在197pb出现了清晰条带，β-globin基因在EA.hy926细胞泳道1411pb出现了清晰条带，而在其他泳道没有出现对应于该种属的目的条带，可判断chPAEC来源于鸡源，为进一步证实培养的是血管内皮细胞，采用CD34相关抗原抗体荧光染色进行鉴定[21]，通过激光共聚焦显微镜下观察，发现胞质均出现绿色的荧光反应，说明所培养细胞为VECs，进而可判断该细胞无交叉污染，后续的实验提供了细胞质量保证。

在前期实验中,发现具有抗炎活性的艾纳香油中含(-)-Linalool和BCP[22]，而他们在chPAEC方面的抗炎作用还是未知的，所以本文对(-)-Linalool和BCP在chPAEC方面的炎性损伤进行了研究。然而，目前国内外关于鸡的VECs方面的研究还较少，因而它的抗体也比较少，所以在本研究中只做一部分基因的蛋白表达。研究结果表明(-)-Linalool和BCP可降低了LPS刺激chPAEC的TNF-α、IL-6、iNOS、PGE2和COX-2表达，且呈现明显的剂量依赖性。这些结果表明，(-)-Linalool和BCP组分可改善 LPS诱导的血管内皮损伤，降低炎症反应，减少VECs的炎性损伤。进一步研究发现，(-)-Linalool和BCP能显著降低LPS致TLR4/NF-κB信号通路中CD14、TLR4和MyD88 mRNA表达和NF-κBp65蛋白的表达，且呈现明显的剂量依赖性。这些结果提示，(-)-Linalool和BCP通过下调 TLR4/NF-κB 信号通路来发挥作用，而TLR4激活可以诱导VECs中ICAM-1和VCAM-1并降低黏附因子的产生，减弱血管内皮炎症损伤程度。因此，有效干预 TLR4/NF-κB 信号通路对减轻血管内皮细胞炎症导致的血管损伤有极其重要的意义，这些结果将为艾纳香油及其(-)-Linalool和BCP应用于家禽炎症性疾病的防治提供基础理论参考。

猜你喜欢 内皮细胞炎性试剂盒 综述:肠道微生物与炎性肠病间的关系中国比较医学杂志(2022年8期)2022-11-21炎性小体与缺血性脑卒中发病及中医相关机制的研究进展中西医结合心脑血管病杂志(2022年19期)2022-11-19有氧运动和精氨酸补充对高血压的干预作用及其与内皮细胞功能的关系体育科技文献通报(2022年4期)2022-10-21炎性及心肌纤维化相关标志物在心力衰竭中的研究进展中国现代医生(2022年21期)2022-08-22病原菌多重核酸检测试剂盒分析性能质量评价研究传染病信息(2022年3期)2022-07-15玻璃珠-涡旋振荡改良法用于硅藻DNA 提取法医学杂志(2022年1期)2022-06-21眼库获取的角膜内皮细胞密度变化规律及影响因素研究△中国眼耳鼻喉科杂志(2022年3期)2022-05-29上调SIRT1减少同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞凋亡中国循证心血管医学杂志(2022年1期)2022-03-15“糖衣”告诉细胞何时造血科学大观园(2021年1期)2021-01-11为什么确诊新冠肺炎需要核酸检测试剂盒？保健与生活(2020年6期)2020-03-20