三株大兴安岭森林凋落物真菌中次生代谢产物及其抗菌活性研究

甄锦程，司 璐，于洪佳，都婷婷，刘 瑶，单体江，徐利剑*

1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；
2华南农业大学林学与风景园林学院，广州 510642

真菌物种丰富且可以产生多样的次生代谢产物，其中包括可以应用在医药与农药领域的抗菌化合物[1]。森林凋落物的分解依赖于真菌的多样性，森林凋落物也被认为是真菌的良好栖息地。大兴安岭森林凋落物中的真菌资源丰富，Zhang等[2]在大兴安岭森林凋落物中，发现6株真菌的提取物具有抗菌活性，在2株真菌中得到4个单体化合物。Qiu[3]在大兴安岭森林凋落物真菌中分离得到了2个具有抗细菌活性的单体化合物。本研究以三株具有抗菌活性的大兴安岭森林凋落物真菌为材料，对其产生的主要抗菌化合物进行分离鉴定，共得到8个化合物(见图1)，其中有2个化合物为新结构天然产物，5个化合物具有抗菌活性。本研究为进一步利用森林凋落物真菌产生的抗菌化合物奠定了基础。

图1 化合物1～8的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-8

1.1 仪器与试剂

核磁共振仪(Bruker Avance III 400，德国)；
高分辨质谱仪(Bruker maXis，美国)；
柱层析用硅胶(青岛海洋公司，100～300目)；
Sephadex LH-20凝胶(GE Healthcare，美国)；
旋转蒸发仪(上海亚荣仪器公司，RE-52AA)；
卧式恒温培养摇床(上海捷呈实验仪器有限公司，TS-211B)；
恒温培养箱(上海博讯有限公司，BIC-250)；
分析型高效液相色谱(岛津企业管理有限公司，LH-20A)；
半制备型高效液相色谱(北京慧德易科技有限公司，QuikSep LC-10)；
甲醇等色谱纯试剂(北京迈瑞达科技有限公司)；
氘代试剂(上海麦克林生化科技有限公司)；
金霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 真菌材料

三株真菌分离自大兴安岭森林凋落物样品，分别为Berkleasmiumsp.SGSF622(GeneBank登录号：MZ778149)、Oidiodendronsp.SGSF289(GeneBank登录号：ON171371)和Parapyrenochaetasp.SGSF062(Genebank登录号：MK192906)，菌株保藏在黑龙江大学植物病理学实验室。经活性筛选，三株真菌乙酸乙酯提取物都表现出了抗菌活性。

1.3 真菌的发酵

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、1 000 mL水，灭菌后冷却备用。将真菌SGSF622接种至90 mm的PDA平板，共接种200个，在25 ℃条件下静置培养14 d。酵母提取物蔗糖培养基(YES)配方：1 000 mL蓝盖瓶中蔗糖10 g、酵母浸粉2 g、硫酸镁0.1 g，100 mL水，根据溶液体积加入适量蛭石，灭菌后冷却备用。将真菌SGSF289和SGSF062接种至YES培养基，每种真菌接种20瓶，在25 ℃条件下静置培养14 d。

1.4 提取与分离

真菌培养发酵结束后，利用等体积乙酸乙酯提取24 h，重复3次，减压浓缩获得SGSF622提取物3.0 g、SGSF289提取物5.3 g和SGSF062提取物4.8 g。提取物进行正相硅胶柱层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇(100∶0、100∶0.5、100∶1、100∶2、100∶3、100∶5、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100)进行洗脱获得10个组分，记为Fr.1～Fr.10。SGSF622的Fr.2与Fr.3～Fr.4通过Sephadex LH-20柱层析，二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱。进一步通过半制备液相，甲醇-水洗脱(0～4 min，10%甲醇；
4～55 min，10%→90%甲醇；
55～70 min，90%→100%甲醇；
70～90 min，100%甲醇)。SGSF622得到两个化合物：化合物1(2 mg，tR=55 min)、2(2 mg，tR=61 min)。同SGSF622分离过程相同，SGSF289的Fr.3～Fr.4中分离了2个化合物：化合物3(4 mg，tR=26 min)和4(2 mg，tR=22 mg)，SGSF062的Fr.2、Fr.4、Fr.6～Fr.7中分离得到4个化合物：化合物5(4 mg，tR=24 min)、6(2 mg，tR=20 min)、7(3 mg，tR=22 min)和8(2 mg，tR=16 min)。

1.5 抑菌活性测定

利用96孔板测定化合物最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。测试菌株包括用青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)BXL015、丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringae)BLY016、甘蓝黑腐黄单胞菌(Xanthomonascampestrus)BLY013、水稻黄单胞菌(X.oryzae)CCTCC AB 91123。其中水稻黄单胞菌来自中国典型培养物中心，其他菌株来自于黑龙江大学植物病理学实验室。采用96孔板微量稀释法[4]，对化合物1～8进行抗菌实验。在96孔板上，第1孔加入100 μL的LB液体培养基和2 mg/mL的待测化合物溶液母液100 μL，混合均匀后，在96孔板中进行倍半稀释，使每孔待测化合物终浓度为1000 μg/mL至0.98 μg/mL，每个浓度3次重复，28 ℃细菌培养箱培养1天后，对细菌培养液浑浊度进行观察，培养液最澄清的最低化合物浓度为该待测化合物的最低抑菌浓度(MIC)，金霉素作阳性对照，DMSO作阴性对照，空培养基作空白对照。

2.1 化合物结构的鉴定

化合物1白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
HR-ESI-MS：m/z381.054 2[M-H]-(calcd for C21H14ClO5，381.053 5)，推测分子式为C21H15ClO5，其NMR数据见表1。经文献查阅，发现化合物1结构与已知化合物Sch53825的结构最为相近[5]，差异在于化合物1比Sch53825多一个甲氧基信号(-OCH3)δC：57.0，δH：3.57(s，3H)；
化合物1的C-1(δ69.3)化学位移值低场区移动了7.8 ppm和C-2(δ51.8)化学位移值高场区移动了1.1 ppm。在HSQC谱中，H-11与C-11相关；
HMBC谱中，H-11与C-1相关(见图2)，确定了甲氧基的位置。综合上述信息，鉴定该化合物为1-甲氧基-Sch53825。

表1 化合物1的1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)数据(CDCl3)

图2 化合物1和2的1H-1H COSY和HMBC相关 Fig.2 The 1H-1H COSY and HMBC correlations for compounds 1 and 2

1996年，Chu等[5]分离得到两个新化合物Sch53823与Sch53825，化合物Sch53825的结构主要通过与化合物Sch53823的波谱数据比对及采用化学衍生化的方式得到判断。实验成功将化合物Sch53825衍生化为乙酰化产物Sch53829，并对化合物Sch53829通过二维核磁共振数据(包括NOESY谱图)分析的方式确定出化合物的平面结构及相对构型。因此，化合物Sch53825的构型同样得到确定。2000年，Bode等[6,7]采用13C、18O同位素标记实验对化合物cladospirone bisepoxide生物合成途径中的关键中间体与终产物实现分离及结构鉴定，阐明了化合物完整的生物合成途径。根据该类化合物的生物合成途径，可见化合物结构中C-2、C-3位双键氧化为三元氧环基团后，化合物H-2与H-3的空间朝向均为α[8]。因此，根据与类似物一致的生物合成途径，化合物1结构中H-2与H-3的空间朝向保持一致。通过分析H-1与H-2间的耦合常数(J= 2.4 Hz)，暗示H-1与H-2间为顺式构型，通过比对化合物1与确定构型的类似物之间的波谱数据，该数据与文献中顺式构型的耦合常数相符[5,9-13]。根据以上数据推断化合物1的构型与化合物Sch53825一致。化合物1和2的详细结构鉴定数据原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

化合物2淡黄油状，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
HR-ESI-MS：m/z357.228 8[M+COOH]-(calcd for C19H33O6，357.227 3)，推测分子式为C18H32O4。化合物2的1H NMR中显示，2个烯烃质子信号δH：6.43(s，1H)和5.96(s，1H)；
3个次甲基信号δH：5.09(m，1H)、4.51(d，1H)、4.24(m，1H)；
9个亚甲基信号δH：1.99(m，2H)、1.95(m，2H)、1.71(m，2H)、1.44～1.32(m，6H)、1.32～1.19(m，6H)；
2个甲基信号δH：1.57(br s，3H)、0.88(t，3H)。化合物2的13C NMR中，显示18个碳信号见表2。再结合1H-1H COSY和HMBC相关数据，该化合物NMR数据与文献报道的化合物Conocandin为相似结构[14]，其化合物基本骨架一致(见图2)，但是化合物2的C-3的C-4的化学位移值由δC：55.0、63.0分别变为δC：73.1、85.3。结合其质谱数据，推测为Conocandin的C-3的C-4的环氧基变为邻二醇结构，即鉴定该化合物为3，4-二羟基-10-甲基-2-亚甲基十六碳-9-烯酸。

表2 化合物2的1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)数据(CDCl3)

续表2(Continued Tab.2)

化合物3白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
分子式为C19H18N2O2。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.08(2H，s，H-1，1′)，7.66(2H，dd，J= 8.0，8.0 Hz，H-5，5′)，7.39～7.32(2H，m，H-8，8′)，7.25～6.98(6H，m，H-2，2′，6，6′，7，7′)，4.76(1H，d，J= 7.2 Hz，H-10)，4.56(1H，td，J= 6.9，3.6 Hz，H-11)，3.71(2H，m，H-12)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：122.7(C-2)，119.4(C-3)，127.3(C-4)，116.8(C-5)，119.7(C-6)，122.3(C-7)，111.2(C-8)，136.4(C-9)，37.0(C-10)，74.8(C-11)，65.3(C-12)，122.4(C-2′)，119.3(C-3′)，126.9(C-4′)，115.4(C-5′)，119.52(C-6′)，122.2(C-7′)，111.2(C-8′)，136.3(C-9′)。以上 数据与文献[15]报道一致，故鉴定该化合物为3，3-二-(3-吲哚)丙烷-1，2-二醇。

化合物4白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
分子式为C16H17N3O2；
HR-ESI-MS：m/z284.139 4[M+H]+(calcd for C16H18N3O2，284.139 4)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.15(1H，s，H-16)，7.59(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6)，7.40(1H，d，J= 8.2 Hz，H-3)，7.31(1H，s，H-9)，7.25～7.21(1H，m，H-4)，7.13(1H，d，J= 5.6 Hz，H-5)，5.72(1H，s，H-11)，4.38(1H，d，J= 10.8 Hz，H-14)，3.77(1H，dd，J= 15.1，3.0 Hz，H-10)，3.71～3.54(1H，m，H-10)，2.97(2H，dd，J= 15.1，10.8 Hz，H-17)，2.40～2.28(2H，m，H-18)，2.03～2.01(2H，m，H-19)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：136.7(C-2)，111.6(C-3)，122.9(C-4)，120.1(C-5)，118.5(C-6)，126.7(C-7)，110.0(C-8)，123.3(C-9)，26.9(C-10)，54.5(C-11)，165.1(C-12)，59.2(C-14)，169.4(C-15)，45.5(C-17)，22.6(C-18)，28.4(C-19)。以上数据与文献中的两个同分异构体brevianamide F与环(D-色-L-脯)二肽进行比较[16]，发现化合物4与环(D-色-L-脯)二肽的数据一致，故鉴定该化合物为环(D-色-L-脯)二肽。

化合物5白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
分子式为C11H12O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.38(1H，s，6-OH)，6.33(1H，s，H-5)，4.73～4.62(1H，m，H-3)，3.98(3H，s，H-11)，2.84(1H，d，J= 2.2 Hz，H-4)，2.83(1H，s，H-4)，1.51(3H，d，J= 6.3 Hz，H-2)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：170.1(C-1)，20.7(C-2)，75.9(C-3)，34.4(C-4)，105.3(C-5)，154.9(C-6)，133.0(C-7)，155.5(C-8)，102.2(C-9)，135.6(C-10)，60.9(C-11)。以上数据与文献[17]报道一致，故鉴定该化合物为6-demethylkigelin。

化合物6白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
分子式为C11H12O6。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.60(1H，s，H-5)，4.45(2H，m，H-3，4)，3.83(3H，s，H-11)，1.44(3H，d，J= 5.8 Hz，H-2)；
13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：170.5(C-1)，18.3(C-2)，81.4(C-3)，69.5(C-4)，106.7(C-5)，158.9(C-6)，135.8(C-7)，157.5(C-8)，100.9(C-9)，140.3(C-10)，60.9(C-11)。以上数据与文献[18]报道一致，故鉴定该化合物为lignicol。

化合物7白色粉末状固体，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂；
分子式为C9H7NO。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：10.08(1H，s，H-1)，8.74(1H，s，H-10)，8.33(1H，t，J= 8.0，4.0 Hz，H-5),7.86(1H，d，J= 2.9 Hz，H-2)，7.49～7.40(1H，m，H-8)，7.34～7.32(2H，m，H-6，7)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：136.6(C-2),119.8(C-3)，124.5(C-4),124.4(C-5)，122.0(C-6)，123.1(C-7)，111.5(C-8)，135.2(C-9)，185.2(C-10)。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定化合物为indole-3-carboxaldehyde。

化合物8白色粉末状固体，易溶于甲醇；
分子式为C14H20N2O5。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.03(2H，d，J= 8.3 Hz，H-2，6)，6.70(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)，4.36(1H，s，H-8)，4.04(1H，dd，J= 10.6，6.3 Hz，H-2′)，3.55(1H，dd，J= 20.3，8.5 Hz，H-5′)，3.36(1H，dd，J= 12.4，6.1 Hz，H-5′)，3.09(1H，dd，J= 14.2，5.1 Hz，H-7)，3.02(1H，dd，J= 14.2，4.6 Hz，H-7)，2.13～2.05(1H，m，H-3′)，1.80(2H，s，H-4′)，1.28～1.13(1H，m，H-3′)；
13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：127.6(C-1)，132.1(C-2，6)，116.2(C-3，5)，157.7(C-4)，37.7(C-7)，57.9(C-8)，167.0(C-9)，170.8(C-1′)，60.1(C-2′)，29.4(C-3′)，22.7(C-4′)，45.9(C-5′)。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定化合物为N-(5-amino-2-hydroxy-1-oxopentyl)-tyrosine。

2.2 单体化合物最低抑菌浓度的测定

对单体化合物对植物病原细菌的抗菌活性测试结果见表3，金霉素为阳性对照。化合物2对不同革兰氏阴性细菌的活性不同，其中对青枯劳尔氏菌的抑菌活性较强，MIC值为7.81 μg/mL，对水稻黄单胞菌其次，MIC值为31.25 μg/mL，化合物3对青枯劳尔氏菌有明显抗菌活性，MIC值为62.5 μg/mL。化合物1、5和6表现了微弱的抗菌活性，化合物4、7和8没有表现出特别明显的抗菌活性。化合物1与Sch53825结构类似，据文献报道螺二萘类化合物具有较好的生物活性[21-24]，但化合物1的抑菌活性弱于Sch53825。

表3 化合物的最低抑菌浓度

本研究在三株大兴安岭森林凋落物真菌SGSF622、SGSF289和SGSF062中分离获得8个化合物，包括两个新化合物，1-甲氧基-Sch53825(1)与3，4-二羟基-10-甲基-2-亚甲基十六碳-9-烯酸(2)，解析了它们的平面结构，但它们的立体构型还有待进一步研究，它们的旋光数据及其他波谱数据，也有待进一步补充。本文中化合物的立体结构是通过对比文献的核磁数据得出，其准确绝对构型还有待进一步研究。本研究的三株真菌隶属的真菌属，都曾被报道过天然产物结构及其生物活性：Berkleasmium属真菌曾被报道过具有抗真菌、抗细菌及抗肿瘤活性[21-24]，2009年Cai等[22]报道从内生菌Berkleasmiumsp.Dzf12发酵液中分离diepoxinη和diepoxinζ的混合物以及diepoxinκ，它们与本文中化合物1具有类似结构同属于螺二萘类化合物，该文还报道了它们对大肠杆菌(Escherichiacoli)、根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、番茄疮痂病菌(X.vesicatoria)、黄瓜角斑病菌(P.lachrymans)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等有较好的抑制活性。Oidiodendron真菌曾分离到10-methoxydihydrofuscin、fuscinarin和fuscin。这些化合物被发现可以有效地与巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1R结合到人类CCR5上，CCR5是一个重要的抗HIV-1靶点，可以干扰HIV进入细胞[25]，本研究中未发现这些化合物。Qiu[3]在Parapyenchaeta属真菌SGSF449分离其天然产物，从其发酵物中分离代谢产物4，6，8-三羟基-7-甲氧基-3-甲基二氢异香豆素，该化合物首次于柱顶孢霉属(Scytalidium)中分离出来，命名为lignicol[18]，与本文化合物6的化学结构一致。本研究首次报道化合物1与化合物2的波谱数据，以及化合物2和化合物3抑制细菌的活性。除化合物6外，其余化合物均为首次从三株真菌所属的真菌属中分离得到[3]。本研究丰富了大兴安岭森林凋落物真菌的天然产物的研究，为进一步开发利用大兴安岭森林真菌资源打下了基础。

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