播种密度对不同季节半夏生长、品质及土壤酶活性的影响

周武先 李梦歌 谭旭辉 汪友元 王 华 蒋小刚 段媛媛 张美德

（1湖北省农业科学院中药材研究所，445000，湖北恩施；
2天门市农业科学院，431700，湖北天门）

播种密度是影响作物生长发育的重要因素之一。播种密度的变化会影响单位面积内植株数量，使作物对水分、矿质营养和光照的竞争程度发生改变，从而影响作物的产量和品质[1-3]。合理密植是促进作物高产增质的重要途径，可提高作物对土壤养分和光能的利用效率，构建合理的种群密度可以最大程度地发挥作物的生产潜能[4-7]。播种密度过低或过高均不利于作物的生长发育和生产性能。播种密度过低会导致作物无法充分利用土壤养分和光能，且容易滋生杂草，经济效益较低；
反之则会导致群体过于拥挤，通风和透光性较差，作物对光、水和土壤养分等的竞争加剧，群体的光合生产能力下降，产量不仅得不到提升，还容易爆发病虫害而导致产量下降。因此，合理的播种密度有利于发挥作物最大的生产效能，提高作物产量和经济效益[5-7]。

土壤酶是存在于土壤中专一性很强的生物催化剂，参与土壤中几乎所有的生物化学反应，在养分循环、能量代谢和动植物残体降解等过程中发挥着重要作用[8]。土壤酶主要来源于植物根系分泌物、土壤微生物活动以及动植物残体腐解等过程，其与土壤类型、土壤理化性质、施肥用药以及农业栽培措施等密切相关，可以反映土壤中养分转化能力，是代表土壤肥力的有效生物学指标[9]。土壤酶活性大小反映土壤生态系统中生物化学过程的相对强度，测定土壤酶活性可以间接了解某类物质在土壤中的转化情况，指导农业生产实践[8]。土壤脲酶（URE）能促进土壤中尿素转化为植物可利用的氮素，可通过URE活性了解土壤氮素代谢情况[10]。土壤磷酸酶可促进土壤中有机磷化合物的矿化和水解，生成可供植物吸收利用的无机态磷，土壤有效磷水平与土壤磷酸酶活性大小密切相关[11]。土壤蔗糖酶（SAC）主要参与土壤有机质的分解和转化，是表征土壤生物化学活性的重要酶[12]。土壤过氧化氢酶（SCAT）主要参与过氧化氢（H2O2）的分解，减轻H2O2对植物的毒害，且与土壤中的有机质含量和微生物数量密切相关[13]。

半夏[Pinellia ternata(Thunb.)Breit]为天南星科多年生草本植物，以干燥球茎入药，具有燥湿化痰、降逆止呕和消痞散结等功效，是我国常用的中药材之一[14]。目前关于播种密度对半夏生长发育、产量和品质影响的研究较多[15-20]，但播种密度对耕层土壤酶活性影响的研究却鲜见报道。因此，本研究采用大田试验，观察播种密度对不同季节半夏生长发育、品质形成和土壤酶活性的影响，为半夏高效优质栽培提供科学依据。

1.1 试验材料

试验材料为湖北省天门市野生转家植半夏（Pinellia ternata），为天门市地理标志保护品种，购自天门市汪场镇当地农户，材料直径约1cm。

1.2 试验地概况

试验于天门市汪场镇半夏规范化栽培示范基地（113°3′40″E，30°36′46″N，海拔 19m）进行。试验地属北亚热带季风气候，光照充足，气候湿润，四季分明。年均温度17.5℃～18.2℃，相对湿度78%，日照时数1966h，无霜期242～263d，年均降水量1300mm。试验地土壤为棕褐色壤土，pH 7.82，有机质21.4g/kg、碱解氮108.1mg/kg、速效磷18.8mg/kg、速效钾209.2mg/kg。

1.3 试验设计

根据天门市当地药农的播种用量习惯（2000～6000kg/hm2），设置6个播种密度，分别为2250、3000、3750、4500、5250 和 6000kg/hm2，每个处理重复4次（小区），每个小区6m2，中间做横隔，将小区分成2个3m2地块，小区随机排列。2019年1月翻耕均匀，施入3000kg/hm2有机肥（pH 7.80，有机质≥45%，N+P2O5+K2O≥5%，购自湖北田头生物科技有限公司）作为基肥，将半夏种茎均匀撒播后覆土2～3cm，其他田间管理统一参照当地进行。分别于春季（4月底）和秋季（10月底）开始倒苗时取样，每次取样3m2，测定半夏株高、叶片形态特征和产量，并取耕层（10～20cm）土壤，带回实验室阴干后测定土壤酶活性。半夏样品带回实验室后洗净切片，于50℃烘干后测定生物碱、黄酮、总蛋白和可溶性糖含量等品质指标。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 形态特征、叶绿素相对含量（SPAD）和产量 用钢卷尺测量株高，参照周武先等[21]的方法测定叶片形态特征和SPAD。每个小区随机选取6株半夏进行测定，然后取平均值作为单个小区的整体水平。将小区其中1个3m2地块的半夏全部采挖，抖净泥土，使用30公斤级金旺电子秤（HY-809）称重，换算成每公顷产量，产量增量=产量-播种量。

1.4.2 品质指标 参考张楠等[22]的方法稍作修改进行半夏生物碱含量的测定，精密称取粉碎并过65目筛的半夏粉末0.2g到25mL磨口具塞试管中，依次加入浓氨水1mL和甲醇10mL，充分摇匀、涡旋，超声30min后取出样品，再次摇匀、涡旋，然后继续超声30min。超声结束后将上清液使用定性滤纸过滤于直径为90mm的蒸发皿中，滤液置于85℃水浴锅中蒸干。取50mL三角瓶，加入蒸馏水5mL，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.4）5mL，0.05%的溴麝香草酚蓝溶液1mL，充分摇匀形成显色液。然后在蒸干甲醇的蒸发皿中分多次累计加入氯仿10mL，充分摇匀、涡旋，转入上述显色液中。将混合液振摇1min后转入分液漏斗，静置后待分层，取氯仿层，使用UV-1800紫外分光光度计（日本岛津，Shimadzu）测定其OD416的吸光度值。总黄酮含量的测定参考何书美等[23]的方法稍作修改，将0.2g半夏粉置于10mL的离心管中，用10mL 50%乙醇超声提取30min。然后10000转/min离心25min。取上清液5mL置于100mL的烧杯中，加入1.5% AlCl3溶液8mL和0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5）4mL，充分混匀，使用50%乙醇水溶液定容到25mL容量瓶。30min后，用分光光度计在415nm波长下测量混合溶液的吸光度值。参照张楠[24]的方法测定总蛋白和可溶性糖含量。

1.4.3 土壤酶活性 土壤酶活性指标包括URE、SAC、碱性磷酸酶（ALP）和SCAT，参照关松荫[25]的方法进行测定。采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定URE活性，用24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示；
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定SAC活性，用24h后1g干土生成葡萄糖毫克数表示；
采用磷酸苯二钠比色法测定ALP活性，以2h后1g土壤中生成的游离酚毫克数表示；
采用高锰酸钾滴定法测定SCAT活性，用20min后滴定1g土壤消耗0.02mol/L高锰酸钾的毫升数表示。

1.5 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析和单因素方差分析（one-way ANOVA），采用新复极差法（Duncan）进行多重比较（α=0.05）。利用Pearson法对半夏生理、生长性状及其土壤酶活性进行相关性分析。采用Origin 8.5作图，图表中数据均为平均值±标准偏差（SD）。

2.1 不同播种密度对半夏形态特征和SPAD值的影响

从图1可知，无论是春季还是秋季，播种密度≤3750kg/hm2时，半夏的株高没有显著差异。春季播种密度为6000kg/hm2时，半夏株高相比于低密度处理（2250kg/hm2）显著降低14.8%。秋季播种密度≥4500kg/hm2时，半夏株高相比于低密度处理均显著降低，降幅分别为10.2%、16.5%和17.7%。春季不同播种密度处理间叶长没有显著差异；
秋季播种密度为3750kg/hm2时，叶长显著高于5250kg/hm2处理，其他处理间没有显著差异。在春季，随着播种密度的增加，叶宽基本呈先增加后下降的趋势，并以4500kg/hm2处理叶宽最大；
在秋季，随着播种密度的增加，叶宽呈逐渐下降的趋势，播种密度≥5250kg/hm2时，叶宽显著低于低密度处理。随着播种密度的增加，叶片SPAD值总体呈下降趋势，但不同播种密度处理间没有显著性差异。综上表明，播种密度对半夏的形态特征有一定的影响，但总体影响不大。

图1 不同播种密度对半夏株高、叶片形态特征和SPAD值的影响Fig.1 Effects of different sowing densities on plant height,leaf characteristic and SPAD value of P.ternata

2.2 不同播种密度对半夏产量的影响

由图2可知，随着播种密度的增加，半夏产量无论在春季还是秋季均呈逐渐上升的趋势。半夏产量在播种密度为6000kg/hm2时最高，春季和秋季产量分别为10 491和14 138kg/hm2。但随着播种密度的增加，半夏产量增量在春季和秋季均呈先上升后下降的趋势。当播种密度为3750～4500kg/hm2时，产量增量在春季和秋季均保持相对较高的水平，分别为5486～5592和9410～9652kg/hm2。由于产量增量直接影响半夏的经济效益，因此并不是播种密度越高，获得的经济效益就越高，适当密植才能使半夏获得更高的经济效益。

图2 不同播种密度对半夏产量的影响Fig.2 Effects of different sowing densities on yield of P.ternata

2.3 不同播种密度对半夏品质的影响

如图3所示，不同播种密度处理对春季半夏生物碱和黄酮含量没有显著影响。随着播种密度的增加，秋季生物碱和黄酮含量呈逐渐下降的趋势。当播种密度≥5250kg/hm2时，秋季半夏生物碱含量显著低于其他播种密度处理；
播种密度≥3750kg/hm2时，秋季半夏黄酮含量显著低于其他低密度处理。随着播种密度的增加，蛋白质含量呈逐渐下降的趋势，当播种密度为2250kg/hm2时，蛋白质含量在春季和秋季均最大，分别为27.2和28.5mg/g；
当播种密度为6000kg/hm2时，蛋白质含量在春季和秋季均最小，分别为23.5和26.4mg/g。可溶性糖含量随着播种密度的增加呈逐渐上升的趋势。当播种密度为2250kg/hm2时，可溶性糖含量在春季和秋季均最小，分别为13.1和14.1mg/g；
当播种密度为6000kg/hm2时，可溶性糖含量在春季和秋季均最大，分别为14.0和15.1mg/g。综上可知，半夏的营养品质指标会随着生长时期和播种密度的不同而发生改变。

图3 不同播种密度对半夏品质的影响Fig.3 Effects of different sowing densities on quality of P.ternata

2.4 不同播种密度对半夏土壤酶活性的影响

如图4所示，随着播种密度的提升，土壤ALP活性在春季基本呈逐渐上升的趋势，并在播种密度为5250kg/hm2时达到最大；
而在秋季则呈先上升后下降的趋势，并在播种密度为3750kg/hm2时达到最大。URE活性在春季随着播种密度的增加呈先上升后下降的趋势，并在播种密度为4500kg/hm2时达到最大；
而秋季URE活性随着播种密度的增加没有表现出特定的规律，在播种密度为3750kg/hm2时最高。SAC活性无论在春季还是秋季，均随着播种密度的增加而增加，且均以播种密度为6000kg/hm2时达到最大。随着播种密度的增加，SCAT活性在春季基本呈先下降后上升的趋势，并在播种密度为5250kg/hm2时达到最大；
而在秋季基本呈逐渐上升的趋势，并在播种密度为6000kg/hm2时达到最大。在半夏的不同生长阶段，春季与秋季土壤酶活性存在较大差异。春季时ALP、URE和SCAT活性显著高于秋季，而春季SAC活性显著低于秋季。由此可见，不同季节和播种密度均会影响半夏土壤酶活性，进而影响土壤中生物化学反应的强度和方向。

图4 不同播种密度对半夏土壤酶活性的影响Fig.4 Effects of different sowing densities on soil enzyme activities of P.ternata

2.5 半夏的产量、品质和土壤酶活性与播种密度和生长时期的相关性分析

从表1可知，无论在春季还是秋季，半夏株高、叶长、叶宽和SPAD值均与播种密度呈负相关关系。产量与播种密度呈显著（P＜0.01）正相关关系，但产量增量与其呈负相关关系。春季半夏蛋白质含量与播种密度呈显著负相关关系。无论在春季还是秋季，可溶性糖含量均与播种密度呈显著正相关关系。秋季生物碱、黄酮和蛋白质含量与播种密度呈显著负相关关系。在春季，ALP、SAC和SCAT活性与播种密度均呈显著正相关关系，而URE活性与播种密度呈显著负相关关系。在秋季，URE、SAC和SCAT活性与播种密度均呈显著正相关关系，而ALP活性与其呈负相关关系。由此可见，播种密度对半夏生长发育、品质形成和土壤酶活性有重要影响。

表1 不同生长时期播种密度与半夏形态特征、产量、品质和土壤酶活性的相关性Table 1 Pearson correlation coefficients between sowing densities and morphological characteristics,yield,quality and soil enzyme activities of P.ternata in different growth stages

由表2可知，不同播种密度和季节均会显著影响半夏的产量、品质和土壤酶活性。播种密度和季节的交互作用对半夏产量、产量增量和可溶性糖含量没有显著影响（P＞0.05），但极显著影响生物碱、黄酮、蛋白质含量和土壤酶活性。说明半夏产量、品质和土壤酶活性与半夏播种密度及其生长时期存在密切联系。

表2 基于方差分析的P值检验生长时期、播种密度及其交互作用对半夏产量、品质和土壤酶活性的影响Table 2 P-values from ANOVA testing effects of growth stage,sowing density and their interaction on P.ternata yield,quality and soil enzyme activities

半夏生长性状、品质与土壤酶活性的冗余分析（RDA）见图5，春季（图5a）和秋季（图5b）的RDA第1排序轴分别解释了变量的76.6%和70.4%，第2排序轴分别解释了变量的19.8%和26.5%，前2个排序轴均解释了变量的95%以上，说明选定的土壤酶活因子可以很好地解释半夏生理生长的变化。不同播种密度处理样本在RDA平面上分散聚集，说明不同播种密度处理的半夏生理生长性状存在较大差异。不同土壤酶活因子按照对半夏生理、生长性状的影响从大到小排列，在春季为ALP（62.5%，P=0.002）＞SAC（61.7%，P=0.002）＞URE（44.7%，P=0.004）＞SCAT（33.0%，P=0.010）；
在秋季为SCAT（54.1%，P=0.002）＞SAC（49.9%，P=0.002）＞ALP（28.8%，P=0.006）＞URE（17.8%，P=0.046）。由此可见，半夏在不同生长时期受土壤酶活性的影响存在显著差异。

图5 春季(a)和秋季(b)半夏生长性状、品质与土壤酶活性的冗余分析Fig.5 The redundancy analysis of growth trait,quality and soil enzyme activity of P.ternata in spring(a)and autumn(b)

3.1 半夏的生长发育与播种密度和生长时期的关系

叶片形态特征是植物重要的叶功能性状，对植物的生长发育有一定的指示作用[21,26]，叶绿素是植物进行光合作用的物质基础，与光合速率和营养状况密切相关[27]，而产量是评价植物生长状态的最佳指标。播种密度能引起生长资源的强制分配，密度的增加会导致作物种群内部的竞争加剧，从而影响种群中植株形态特征和生物量[28-29]，这在以往的研究[2-3]中已经得到了验证。本研究结果表明，无论在春季还是秋季，随着播种密度的增加，半夏株高、叶长、叶宽和SPAD值总体呈逐渐下降的趋势，这可能是半夏的一种“耐受”策略，通过减缓自身的生长速度加强对外界胁迫的耐受力，以保证现有的植株最大程度存活，这与冯银平等[30]研究播种密度对苜蓿生长影响的结果类似。本研究还表明，无论春季还是秋季，随着播种密度的增加，半夏产量首先呈上升的趋势，当播种密度达到4500kg/hm2以后，产量逐渐趋于平稳并基本保持不变，产量增量也逐渐减小，这与阮培均等[4]、梅艳等[18]和黄晓杨等[17]研究播种密度对半夏产量影响的结果类似，表明合理密植才能达到最佳的生产效益。半夏经过充分的生长后，群体达到了最大的资源利用率，单位面积生物量不再随着播种密度增加而增加，符合最终产量恒定法则[31]。此外，半夏的产量不仅取决于播种密度（F=345），更取决于半夏的生长时期（F=3859），只有获得充分生长的时间和空间，才能获得更高的生产力。

3.2 半夏的品质与播种密度和生长时期的关系

生物碱是半夏的主要药效成分之一，可以镇咳、降脂和止呕，还具有消炎抑菌和抑制肿瘤的作用[32-33]。黄酮也是半夏的重要活性成分，在治疗癌症、冠心病和保护免疫系统等方面具有十分重要的作用[34]。半夏总蛋白具有明显的生物化学活性，其主要有抗癌和抗早孕作用[24]。半夏可溶性糖可增加体内酶活性，有效消除自由基，同时对人体也具有一定的抗肿瘤作用[35]。本研究结果表明，春季半夏除了生物碱和黄酮含量没有显著变化外，随着播种密度的增加，生物碱、黄酮和蛋白质含量均呈逐渐下降的趋势，这与阮培均等[36]、王海玲等[19]和赵明勇等[20]研究播种密度对半夏总生物碱含量影响的结果类似。这可能是因为播种密度增加导致半夏对光照、空间和土壤养分资源的竞争加剧，光合作用减弱，合成药效活性成分的底物不足，从而限制了生物碱、黄酮和蛋白质的生成[37]。在不同播种密度处理下，春季半夏生物碱和黄酮含量没有发生显著的变化，这可能是因为生物碱和黄酮属于次级代谢产物，而蛋白质和可溶性糖属于初级代谢产物，因此相比于蛋白质和可溶性糖，半夏生物碱和黄酮受播种密度的影响较为滞后。半夏可溶性糖含量无论在春季还是秋季均随着播种密度的增加呈逐渐上升的趋势，这可能与半夏为了适应复杂的生存环境而将体内的蛋白质降解转化成蔗糖和葡萄糖等小分子可溶性糖有关。本研究只测定了生物碱、黄酮、蛋白质和可溶性糖总量的变化，其具体组分的变化和相关作用机制还有待进一步研究。

3.3 半夏的土壤酶活性与播种密度和生长时期的关系

研究[38]表明，不同播种密度条件下土壤酶活性会发生改变，这可能是由于不同群体密度造成植株生长发育不同，致使土壤中根系生物量及分泌物等产生差异而引起的。在不同群体密度条件下，光合代谢的差异也会造成光合产物向根部的输送量发生改变，而相当一部分的光合产物在转移至根部后会随着根系分泌物进入土壤[39]。因而群体密度的变化会间接影响土壤中有机质和分解底物的供给，进而影响微生物的生长及土壤胞外酶的分泌[40]。本研究结果显示，除了秋季的ALP和春季的URE活性外，其他土壤酶活性在半夏的整个生长过程中基本呈上升的趋势。这可能是因为半夏个体间的竞争情况随着播种密度的增加而愈加激烈，高群体密度条件下半夏需要吸收更多的土壤养分，从而导致了土壤养分的可获得性降低，进而通过促进土壤微生物和植物释放更多的胞外酶来获得养分。此外，高群体密度条件下半夏根系生物量和分泌物较多，给土壤微生物提供了丰富的有机质和分解底物，从而使土壤胞外酶的分泌增加。春季ALP、URE和SCAT活性整体高于秋季，这可能是由于春季半夏的代谢活动旺盛，需要消耗大量的养分，因此促使根系向土壤分泌较多的胞外酶以满足自身对养分的需求和对环境的适应。而秋季半夏临近采收，代谢活动减弱，对养分的需求降低，根系分泌物减少，土壤微生物活性也相应降低，因此3种酶活性下降。春季SAC活性显著低于秋季，这可能是因为秋季半夏体内生成更多的可溶性糖需要消耗大量的小分子有机物，因而刺激根系向土壤分泌更多的SAC。

3.4 半夏的产量、品质和土壤酶活性与播种密度和生长时期的关系

从不同生长时期播种密度对半夏产量、品质和土壤酶活性的影响来看，半夏产量、品质和土壤酶活性不仅受播种密度的影响（P＜0.001），与生长发育阶段也息息相关（P＜0.001），且生长时期和播种密度的交互作用也会对生物碱、黄酮、蛋白质含量和土壤酶活性产生极显著的影响（P＜0.001）。从半夏产量、品质与土壤酶活性的RDA来看，在不同生长阶段，不同的土壤酶发挥着相应的主导作用，使半夏始终处于相对较好的生长状态。因此，合理安排半夏的播种密度及掌握采收时间可以使土壤发挥较大的生产潜力。

在不同的播种密度处理下，半夏可通过调整植株和叶片形态特征，使群体更加适应因播种密度增加而导致生存资源匮乏的生长环境。随着播种密度的增加，半夏的产量呈先增加后趋于平缓的趋势，符合最终产量恒定法则。半夏生长发育、品质和土壤酶活性不仅与半夏的播种密度有关，与生长发育阶段也存在密切联系，在保障半夏品质不受太大影响的情况下，3750～4500kg/hm2的播种密度结合秋季采收可以使土地发挥较高的生产效能，半夏产量增量达到相对较佳的水平。

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