基于双酶水解优化牛肉酶解液工艺及其呈味成分分析
时间：2022-12-07 18:00:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
桂海佳，李江龙，李泽林，王雪峰，谷大海，肖智超，范江平
(云南农业大学 食品科学技术学院，昆明 650201)
随着经济的发展，我国对牛肉的消费需求迅速上升，截至2017年，我国牛肉消费总量为794万吨，位居世界前列[1]。牛肉氨基酸组成与人体接近，是人体必需氨基酸的重要来源。在牛肉屠宰初加工过程中会产生大量副产物，其中骨、血液、内脏、油脂及碎肉残渣等为其主要副产品，对于这些副产品的处理，主要用于制备工业油、骨粉、肥料及燃料等[2]。目前，伴随食品工业的发展，食品调味料也不断发展，其中利用酶解法制备调味料是相对温和、绿色无污染的一种方式，通过添加蛋白酶将食物中的蛋白质水解成多肽或者游离氨基酸可以提高呈味物质的释放，并且相关研究表明水解得到的多肽更有利于消化吸收，且往往还具有抗氧化等多种生物活性[3-5]。
酶具有专一性、高效性等特点，而天然蛋白质组成和结构复杂，因此使用单一酶往往水解不彻底，需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解[6-7]。本研究拟用牛肉加工过程中产生的碎肉等副产物为原料，采用双酶对牛肉副产物进行酶解及对工艺进行优化，然后对酶解液的氨基酸及挥发性成分进行分析鉴定，为后续牛肉副产物调味料的加工利用提供参考。
1.1 材料
牛肉：新鲜牛肉副产物剔除油脂较厚以及筋、腱较多的部分，购于昆明蒜村菜市场。
1.2 试剂
复合蛋白酶(50000 U/g)、碱性蛋白酶(50000 U/g)、风味蛋白酶(50000 U/g)：浙江一诺生物科技有限公司；
木瓜蛋白酶(100000 U/g)：南宁庞博生物工程有限公司；
氢氧化钠、甲醛、硫酸铜、硫酸钾、硼酸：天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.3 主要仪器
PHS-3C型雷磁pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；
JC-SY型电热恒温水浴锅 上海成顺仪器仪表有限公司；
SPH120G型消解仪 阿尔瓦仪器有限公司；
DT5-2型低速台式离心机 北京时代北利离心机有限公司；
S-433D型氨基酸自动分析仪 德国Sykam公司。
1.4 试验方法
1.4.1 牛肉酶解液的制备
1.4.1.1 牛肉酶解工艺流程
牛肉副产物预处理→按一定料液比加水混匀→加酶→调节pH→水浴酶解→灭酶(沸水浴10 min)→离心(4000 r/min离心15 min)→取上清液备用。
1.4.1.2 分步酶解工艺流程
牛肉下脚料预处理→加第一种酶→水浴酶解→灭酶，冷却→加第二种酶→水浴酶解离心→灭酶，冷却→离心取上清液备用。
1.4.2 蛋白酶的筛选
选取复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，在料液比1∶1、加酶量1%及最适温度和pH条件下酶解一定时间，以水解度为指标，确定最佳蛋白酶，条件见表1。
表1 不同蛋白酶制剂及其最适反应条件
1.4.3 单因素试验
在木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶中筛选出较适宜的两种酶，对牛肉进行双酶分步酶解。
风味蛋白酶选择酶添加量(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)、pH(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)、酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)和酶解时间(180，210，240，270，300 min)4个因素，木瓜蛋白酶选择酶添加量(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)、pH(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)、酶解温度(45，50，55，60，65 ℃)和酶解时间(210，240，270，300，330 min)4个因素，以水解度为指标进行单因素试验，对牛肉酶解条件进行优化。
1.4.4 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，以水解度为响应值(Y)，选取对牛肉酶解影响较强的3个因素酶解时间(A)、酶解温度(B)、pH(C)为自变量，利用Box-Behnken中心组合原理，设计三因素三水平的响应面试验，探索牛肉酶解的最佳条件，因素水平见表2和表3。
表2 风味蛋白酶响应面试验因素水平编码表
表3 木瓜蛋白酶响应面试验因素水平编码表
1.4.5 水解度的测定
根据刘媛等[8]的方法，按照以下公式计算水解度：
水解度=水解液中的游离氨基酸量/水解液中的总氮量×100%。
总氨基氮含量采用甲醛滴定法：根据GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》[9]的方法进行测定。
蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[10]，采用凯氏定氮法测定。
1.4.6 挥发性成分测定
样品处理方法：取样品加入20 mL顶空瓶中，加盖密封。
SPME条件：设备：CTC三位一体自动进样器；
萃取头：50/30 μm DVB/CAR/PDMS；
温度：50 ℃；
时间：振荡15 min，萃取30 min；
振荡速度：250 r/min；
解吸时间：5 min；
GC循环时间：50 min。
GC条件：色谱柱：DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；
进样温度：260 ℃；
分流比：无分流；
载气：氦气(99.999%)；
流量：1 mL/min；
柱温：40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min；
接口温度：260 ℃；
MS条件：离子源温度：230 ℃；
四级杆温度：150 ℃；
电离方式：EI+，70 eV；
扫描方式：全扫描；
质量范围：20～400 amu；
NIST 2014谱库。
2.1 单因素试验
2.1.1 单酶的筛选
由图1可知，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的水解效果较好，且木瓜蛋白酶属于内切肽酶，而风味蛋白酶属于外切肽酶，两种酶的作用位点不一致，可以提升水解度，所以本试验选择木瓜蛋白酶、风味蛋白酶作为牛肉酶解最佳用酶。
图1 不同蛋白酶制剂对牛肉酶解效果的影响
2.1.2 pH值对牛肉酶解效果的影响
pH值能影响酶分子的结构稳定性和底物活性部位上有关基团的解离，进而影响与底物蛋白的结合与催化[11]，pH值过高或过低的条件下酶的空间构象会改变，使酶活性降低甚至失活。由图2可知，随着pH值的升高，水解度呈先上升后下降的趋势。木瓜蛋白酶、风味蛋白酶在pH 7.0时水解度都达到最大。
图2 不同pH值对牛肉酶解效果的影响
2.1.3 酶添加量对牛肉酶解效果的影响
由图3可知，当酶添加量不断增加时，水解度总体呈现不断上升的趋势。风味蛋白酶的添加量大于2.5%时，水解度增长速度趋于平缓；
木瓜蛋白酶的添加量小于3.5%时水解度上升明显，大于3.5%时趋于平缓。这是由于起初酶添加量增加时，底物得到充分水解，水解度增加，随着酶添加量的逐渐增大，底物质量浓度相对减小，有一部分酶分子没有机会与底物结合，所以尽管加酶量成倍增加，水解度却趋于稳定[12-13]。出于成本考虑，风味蛋白酶的最佳添加量为2.5%，木瓜蛋白酶的最佳添加量为3.5%。
图3 不同酶添加量对牛肉酶解效果的影响
2.1.4 酶解温度对牛肉酶解效果的影响
由图4可知，温度对牛肉水解效果影响显著，温度可以刺激酶的活性，过高或过低的酶解温度均会影响酶的活性，温度过低不仅影响酶活力，还会使得酶与底物的结合效率降低，抑制酶促反应速率，温度过高则会导致蛋白酶的结构发生不可逆的破坏，从而影响酶解效果[14]。因此，风味蛋白酶的最适酶解温度为50 ℃，木瓜蛋白酶最适酶解温度为55 ℃。
图4 不同酶解温度对牛肉酶解效果的影响
2.1.5 酶解时间对牛肉酶解效果的影响
由图5可知，使用风味蛋白酶，水解度呈先上升再下降再上升的趋势，风味蛋白酶的酶解时间达到240 min时，酶解牛肉的水解度最大，使用木瓜蛋白酶，水解度呈先上升后下降的趋势，木瓜蛋白酶在300 min时水解度达到最大值。这是因为在短时间内，底物充分与蛋白酶结合反应，蛋白质被分解为氨基酸和小分子肽等产物。随着时间的增加，由于底物减少以及反应产物增多对反应产生竞争性抑制作用，降低酶的活性，导致水解度不继续增加反而有所下降[15]。
图5 不同酶解时间对牛肉酶解效果的影响
2.2 响应面试验
2.2.1 风味蛋白酶响应面优化回归模型与方差分析
对表4中数据进行回归分析，结果得到水解度(Y)与酶解时间(A)、酶解温度(B)、pH(C)的二次多项回归方程为：
表4 回归模型方差分析及模型显著性检验
Y=-689.70059+1.53695A+27.09796B-43.01430C-6.04167E-004AB-0.13249AC+0.13733BC-1.22805E-003A2-0.27537B2+4.92022C2。
对回归模型进行方差分析，结果见表4。模型的P<0.01，表明该模型极显著，且失拟项的P=0.8909>0.05，失拟项不显著，说明拟合度好，此模型可用。该回归模型的绝对系数R2=0.9454，RAdj2=0.8751，说明该回归模型可以充分解释该工艺，此模型可用于分析酶解牛肉的工艺优化。根据各因素的显著水平，结合F值大小可以判断对水解度的影响顺序为：酶解温度>pH>酶解时间。
通过模型得到的最优结果为：pH 7.5、酶解温度50.84 ℃、酶解时间210 min，水解度为36.1971%。根据实际情况调整为pH 7.5、酶解温度51 ℃、酶解时间210 min，在此工艺条件下进行3组重复试验，并计算其水解度的平均值为(34.69±0.61)%，与理论值相比误差小，说明该优化结果具有可行性。
2.2.2 风味蛋白酶响应曲面分析
响应曲面图可以反映两个变量之间的交互类型以及各因素对水解度影响的显著性。各因素交互作用对水解度影响的曲面图见图6。
图6 各因素交互作用响应曲面
由图6可知，随着酶解时间、酶解温度和pH的增大，水解度先增大后减小，这与单因素试验结果一致，交互作用显著性与表4中的结果一致。
2.2.3 木瓜蛋白酶响应面优化回归模型与方差分析
对表5中数据进行回归分析，结果得到水解度(Y)与酶解时间(A)、酶解温度(B)、pH(C)的二次多项回归方程为：
表5 回归模型方差分析及模型显著性检验
续 表
Y=-942.72450+3.35642A+15.04385B+15.62725C-5.91667E-003AB+5.75000E-003AC+0.50600BC-4.99611E-003A2-0.15736B2-3.11900C2。
对回归模型进行方差分析，结果见表5。模型的P<0.01，表明该模型极显著，且失拟项的P=0.1067>0.05，失拟项不显著，说明拟合度好，此模型可用。该回归模型的绝对系数R2=0.9402，RAdj2=0.8634，说明该回归模型可以充分解释该工艺，此模型可用于分析酶解牛肉的工艺优化。根据各因素的显著水平，结合F值大小可以判断对水解度的影响顺序为：酶解温度>酶解时间>pH。
通过模型得到的最优结果为：pH 7.13、酶解温度53.46 ℃、酶解时间308.36 min，水解度为32.5544%。根据实际情况调整为pH 7、酶解温度53 ℃、酶解时间310 min，水解度为32.55%，在此工艺条件下进行3组重复试验，并计算其水解度的平均值为(32.49±1.30)%，与理论值相比误差小，说明该优化结果具有可行性。
2.2.4 木瓜蛋白酶响应曲面
各因素交互作用对水解度影响的曲面图见图7。
图7 各因素交互作用响应曲面图
由图7可知，随着酶解时间、酶解温度和pH的增大，水解度先增大后减小，这与单因素试验结果一致。酶解温度和pH的交互作用显著，酶解时间和酶解温度、pH和酶解时间的交互作用不显著，这与表5中的结果一致。
2.2.5 双酶分步酶解
双酶水解过程中酶的使用顺序不同可能会对酶解效果产生影响，根据风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的响应面试验结果，使两种酶在各自的最佳试验条件下分步对牛肉进行酶解。双酶酶解的工艺条件：木瓜蛋白酶：牛肉与水的比例为1∶1、pH 7、酶解温度53 ℃、酶解时间310 min、酶添加量3.5%；
风味蛋白酶：牛肉与水的比例为1∶1、酶解时间210 min、酶添加量2.5%、酶解温度51 ℃、pH 7.5。
由表6可知，酶的添加顺序对水解度有影响，先加风味蛋白酶再加木瓜蛋白酶低于先加木瓜蛋白酶再加风味蛋白酶水解蛋白的效果，这是因为两种酶作用的位点不同[16]。同时，采用两种不同的酶进行酶解，可以得到不同切割位点的肽段，更加丰富了酶解物的肽链种类，并且木瓜蛋白酶作为内切肽酶，酶解后会产生一定苦味，而风味酶作用于后期可以降低苦味，两者以适当比例复配不仅可以提高水解度，而且可以有效消除酶解产生的不良风味，因此，选择先加木瓜蛋白酶再加风味蛋白酶的加酶顺序。
表6 双酶分步酶解结果分析
2.3 酶解液游离氨基酸分析
氨基酸与酶解液风味的形成紧密相关，氨基酸结构特性影响其呈味特征，如鲜味、苦味、甜味等都受到氨基酸的影响[17]。由表7可知，牛肉酶解前游离氨基酸的种类以丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸和蛋氨酸为主，酶解后含量较丰富的游离氨基酸为亮氨酸、精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，且酶解后游离氨基酸含量明显增加，并且种类齐全，必需氨基酸占总氨基酸含量的59.97%，可为后续的美拉德反应提供底物。酶解前的游离氨基酸总量为1.443 mg/g，酶解后的游离氨基酸总量达到14.801 mg/g，总含量明显增加。谷氨酸、天门冬氨酸主要呈现鲜香味道，酶解后这两种氨基酸的含量显著增加，为酶解液提供了特有鲜香味道。因此，该响应面优化工艺适用于牛肉酶解，所得产物营养价值高，符合产品开发原则。
表7 牛肉酶解前后游离氨基酸比较
续 表
2.4 酶解前后挥发性成分分析
由表8可知，酶解前后共有55种挥发性物质，主要包括8种醇类、5种酮类、2种酸类、6种酯类、3种烯烃类、1种酚类、1种杂环类、13种烷烃类、3种醚类、3种醛类以及10种其他类物质。
表8 酶解前后挥发性成分比较
续 表
续 表
酶解后醇类物质呈现上升趋势的是芳樟醇、乙醇等物质，酶解后出现了庚醇、正己醇、顺-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇等具有香气特征的物质。其中，庚醇具有芳香味，芳樟醇会产生类似铃木花香味，有利于改善酶解液的风味。醇类化合物是肉中脂质降解氧化形成的产物，可赋予牛肉香甜味[18]。酮类化合物多来源于不饱和脂肪酸的氧化中降解，也可能来源于醇类的氧化或酯类的降解[19]。酮类化合物大多具有良好的风味，酸类物质酶解后含量降低，乙酸和己酸酶解后含量降低，己酸呈现汗味，在酶解后不良风味降低。具有水果香的甲酸戊酯下降。2-乙酰基噻唑具有牛肉味的杂环类物质增加。烷烃类化合物主要来源于脂质分解，烷烃类化合物大多香气较弱或无味，但烃类化合物可能作为杂环类化合物的重要中间体对风味形成具有基底作用。烯烃类化合物可作为醛类、酮类物质的前体物质对风味形成具有潜在作用。醛类物质是脂肪经加热产生的，阈值较低，尽管相对含量较低，但往往是评价食物，尤其是肉类风味的可靠指标[20-21]。
分步水解牛肉蛋白的最佳工艺条件为先用木瓜蛋白酶酶解，酶解时间310 min、酶解温度53 ℃、酶添加量3.5%(以底物质量计算)、pH 7，再用风味蛋白酶酶解，酶解时间210 min、酶添加量2.5%(以底物质量计算)、酶解温度51 ℃、pH 7.5，水解度为(41.48±0.34)%，所得酶解液中的游离氨基酸含量明显增加，总量达到14.801 mg/g，采用SPME-GC-MS测定挥发性风味成分，从牛肉酶解液中鉴定出41种化合物。
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