基于网络药理学和分子对接探讨香加皮防治牙周炎的作用机制
时间：2022-12-07 13:55:08 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
姬晓炜，冯 凯，吴泽钰2,，赵 今2,
（1新疆医科大学第一附属医院/附属口腔医院口腔修复科；
2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所；
3新疆医科大学第一附属医院/附属口腔医院牙体牙髓科，乌鲁木齐 830054）
牙周炎（Periodontitis）是细菌在牙齿表面附着形成牙菌斑、牙齿周围组织微循环改变、宿主免疫细胞激活并释放炎症因子等因素引发的慢性感染性疾病[1]。其病因及机制复杂，但细菌毒力因子与机体自身免疫炎症反应失衡是导致组织破坏和功能丧失的最主要因素之一。目前牙周病的治疗方法众多，临床上常采用牙周基础治疗配合全身或局部应用抗生素，此法虽然能取得一定的成效，但长期全身应用抗生素会导致菌群失调，产生耐药性菌株等一系列不良后果。近年来中草药因其副作用小且标本兼治等优点吸引许多学者在中医药治疗牙周炎的领域进行了大量探索。一些中草药的提取物或单体被证实具有抗炎、促进细胞成骨转化和直接或间接的抑制破骨细胞分化和功能的作用[2]。与传统应用抗生素相比，中草药具有生物活性多样、安全性高、不良反应小等特点，对于牙周病的预防和治疗有着较大优势,适合长期用药治疗和预防，能够为牙周炎患者的治疗提供更多的选择[3]。香加皮（Cortex Periplocae Radicis）为萝藦科植物杠柳（Periploca sepium Bge）的干燥根皮。具有利水消肿，祛风湿，强筋骨之功效[4]。香加皮是用于治疗类风湿性关节炎的传统中药，现代药理研究表明，香加皮中主要有C21甾体类、强心苷类、三萜类、醛类以及低聚糖、小分子脂肪酸、黄酮等其他化合物，在强心、抗肿瘤、抗炎以及免疫调节等多方面具有一定药理活性[5-6]。网络药理学是一种新兴的生物信息学研究方法，基于网络的药物发现被认为是一种具有成本效益的药物开发方法[7]。本研究应用网络药理学方法探究香加皮治疗牙周炎的作用靶点和分子机制，以期为未来开发香加皮为治疗牙周炎新药物提供一定理论依据和基础。
1.1 香加皮治疗牙周炎网络药理学分析流程采用TCMSP、ETCM和BATMAN-TCM数据库检索筛选香加皮有效作用成分及靶点，并通过Swiss Target Prediction数据库检索预测成分的作用靶点。应用GeneCards和DisGeNET数据库获取牙周炎相关靶点，将药物与疾病靶点进行韦恩分析获得共同靶点。利用Cytoscape 3.8.2软件构建“成分-靶点”网络，STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并进行关键基因筛选以及MCODE聚类分析，利用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，通过Cytoscape 3.8.2软件构建香加皮“药物-成分-靶点-通路”网络，利用分子对接技术验证药物成分与靶点蛋白对接情况，见图1。
图1 香加皮治疗牙周炎分子作用机制分析流程
1.2 香加皮有效成分及靶点的筛选在TCMSP、ETCM和BATMAN-TCM数据库中检索“香加皮”，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%，化合物类药性（drug likeness,DL）≥0.18为筛选标准[8]，得到香加皮有效化学成分及相关靶点，并通过Swiss Target Prediction数据库预测成分的作用靶点。
1.3 获取牙周炎疾病相关靶点通过GeneCards和Dis-GeNET数据库检索“Periodontitis”，去重后得到牙周炎疾病相关靶点。
1.4 “成分-靶点”网络的构建与分析将得到的药物和疾病靶点利用Venn在线工具取交集获得共同靶点，并绘制韦恩图。使用Cytoscape 3.8.2软件构建“成分-靶点”网络，并进行拓扑学分析，得到节点的度值（degree）、中介中心度（betweenness centrality,BC）、接近中心性（closeness centrality,CC）以及拓扑系数（topological coefficient,TC）等信息。
1.5 PPI网络的构建以及关键靶点的筛选将共同靶点导入STRING数据库，选定物种为“Homo sapiens”，置信度得分>0.4，构建PPI网络，CytoNCA插件分析拓扑属性。利用Cytoscape 3.8.2软件对PPI网络做可视化处理，使用Cytohubb插件计算出基因的核心度，选取MCC评分前十的基因作为关键靶点，使用MCODE插件聚类得到核心功能模块。
1.6 GO和KEGG富集分析利用DAVID数据库对共同靶基因进行GO及KEGG富集分析。选择GO功能中的生物过程（biological process,BP）、细胞成分（cellular component,CC）以及分子功能（molecular function,MF）3个参数对基因进行富集分析。限制物种为“Homo sapiens”，得到的分析结果以筛选错误率（false discovery rate,FDR）<0.001，P<0.001进行筛选，将结果以气泡图形式输出。
1.7 “香加皮-成分-靶点-通路”网络的构建与分析将所得到的成分、靶点、通路导入Cytoscape 3.8.2软件中，利用“Merge”功能将其融合，绘制香加皮“药物-成分-靶点-通路”网络图。
1.8 分子对接验证在PBD和PubChem数据库中下载关键靶点蛋白和香加皮有效成分的结构文件，应用PyMOL和AutoDockTools软件进行预处理。将处理好的文件应用AutoDock Vina软件[9]进行分子对接，结合能越低，表示成分与靶点结合力越强，分子构象越稳定。最后应用PyMOL和LigPlus软件绘制并分析分子对接结果。
2.1 香加皮活性组分的筛选检索得到香加皮的成分79个，筛选后获得17种活性成分，见表1。
2.2 香加皮和牙周炎相关靶点的收集香加皮的17个活性成分通过检索获得去重后靶点440个，检索得到牙周炎疾病相关靶点2 700个。药物与疾病靶点韦恩分析后，得到175个香加皮治疗牙周炎的潜在靶点，见图2和表2。
2.3 “香加皮有效成分-靶点”网络的构建与分析使用Cytoscape 3.8.2软件构建“香加皮有效成分-靶点”调控网络，见图3，共整理出194个关联节点和853对关系数据，网络的平均度值为7.495，拓扑学参数见表3。度值较高的成分有欧奕二烯酮A、杠柳毒苷元、杠柳苷K_qt等，可能是香加皮的核心作用成分。
表1 香加皮17种主要活性成分及药理参数
图2 香加皮-牙周炎共同靶点韦恩图
表2 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点
图3 “香加皮有效成分-靶点”调控网络
表3 香加皮有效成分的拓扑学参数分析
2.4 PPI网络的构建与分析使用STRING数据库构建交集靶点的PPI网络（图4），共175个节点和4572条边，网络的平均度值为52.3，按照度值降序排序筛选出核心靶蛋白30个（图5）。通过Cytohubb插件进行MCC评分，得到排名前十的关键基因如下：TNF、IL6、MAPK3、STAT3、JUN、CASP3、HIF1A、MMP9、PTGS2、MTOR（图6），拓扑学参 数见表4。通过MCODE插件得到3个聚类模块：MCODE1（图7）、MCODE2（图8）、MCODE3（图9），各模块通路描述见表5，主要与癌症途径以及糖尿病并发症中的AGERAGE信号通路以及炎症反应等功能相关。
图4 香加皮治疗牙周炎靶点的PPI网络
图5 香加皮治疗牙周炎的30个核心靶点
图6 香加皮治疗牙周炎的关键基因
表4 香加皮治疗牙周炎核心靶点的拓扑学参数分析
图8 香加皮治疗牙周炎靶点的聚类模块2
图9 香加皮治疗牙周炎靶点的聚类模块3
表5 3个聚类模块对应的通路描述
2.5 GO和KEGG富集分析利用DAVID数据库对175个共同靶点进行GO及KEGG富集分析，各筛选出排名前15者绘制气泡图（图10~13），气泡大小代表富集的基因数量，气泡越大，表明富集的基因数目越多；
气泡颜色代表P值，其值由大到小从红色到蓝色变化。GO富集分析中生物过程相关条目涉及炎症反应、细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应等，细胞成分相关条目涉及质膜、质膜的组成部分、膜筏等，分子功能相关条目涉及RNA聚合酶II转录因子活性、酶结合以及蛋白激酶活性等，见表6。KEGG富集分析得到主要涉及通路包括癌症途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗、脂质与动脉粥样硬化以及人巨细胞病毒感染等通路，见表7。
图10 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点GO富集分析-BP
图11 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点GO富集分析-CC
图12 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点GO富集分析-MF
图13 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点KEGG富集分析
表6 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点GO富集分析结果（各前5条）
GO:0043235 GO:0004879 GO:0019899 GO:0004672 GO:0004712 GO:0042802受体复合体RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合酶结合蛋白激酶活性丝氨酸/酪氨酸激酶活性相同蛋白结合CC MF MF MF MF MF<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 10.3 9.1 16.0 13.7 14.3 26.3 NTRK1,NOTCH2,CSF1R等VDR,NR1H2,NR1I3等TOP2A,NOTCH2,APP等NTRK1,GSK3B,MAP2K1等CSF1R,GSK3B,ROCK1等GABRB3,APP,PRF1等
表7 香加皮治疗牙周炎的潜在靶点KEGG富集分析结果（前10条）
2.6 香加皮“药物-成分-靶点-通路”网络通过Cytoscape 3.8.2的“Merge”功能构建的香加皮“药物-成分-靶点-通路”网络图，存在214个节点，1 360条边，平均度值为12.710，见图14。可见KEGG富集到的前20个信号通路、175个核心靶点、17个活性成分间关系密切。这说明，香加皮中的多种成分可以通过多个靶点调节多条信号通路来达到潜在治疗牙周炎的作用。
图14 香加皮“药物-成分-靶点-通路”网络图
2.7 香加皮有效成分与关键靶点分子对接分析为进一步验证靶点蛋白与对应药物有效成分之间的结合活性，将PPI网络中筛选得到的10个关键靶点蛋白与对应香加皮有效成分进行分子对接，当结合键能<-5 kcal/mol时，表明两者对接结果良好。分子对接结果如表8所示，通过PyMOL和LigPlus软件对分子对接结果进行可视化，部分分子对接模式图，见图15~19。结果表明，香加皮有效成分与关键靶点之间具有良好的对接活性，进一步证实香加皮可通过多种有效成分作用于关键靶点来治疗牙周炎。
表8 香加皮有效成分与关键靶点结合能预测/（kcal/mol）
图15 靶点CASP3与成分Glycoside H2分子对接模式
图16 靶点MAPK3与成分Neridienone A分子对接模式
图17 靶点MTOR与成分Periplogenin分子对接模式
图18 靶点PTGS2与成分Xysmalogenin分子对接模式
图19 靶点STAT3与成分Periplocymarin分子对接模式
本研究利用网络药理学方法初步探讨了香加皮在治疗牙周炎方面潜在的分子机制，经筛选得到杠柳苷E、H2、K、香加皮苷E、M、O、杠柳毒苷元、杠柳次苷等17种药物活性成分。有研究发现，香加皮苷E在体内外能显著抑制T细胞活化，并以剂量依赖性方式抑制白细胞介素2和干扰素γ的产生[10]。杠柳毒苷元具有抗炎、强心、利尿及抗肿瘤等作用，其药物开发潜力较大。顾卫等[11]通过研究发现，杠柳毒苷元对体外培养的肥大细胞以及整体动物的肥大细胞均可产生显著抑制脱颗粒和组胺释放作用，且具有明显的剂量依赖性，证明杠柳毒苷元可能是香加皮发挥抗炎作用的物质基础。另外，杠柳毒苷元可能通过上调凋亡基因caspase-3及其蛋白酶的表达而诱导癌细胞凋亡[12]。杠柳次苷也可通过抑制PI3K-Akt信号通路诱导癌细胞凋亡[13]。3-epi-β谷甾醇与β谷甾醇两者分子式和分子质量相同，仅3D结构式不同，此处将两者归为一类探讨其作用效应。β谷甾醇广泛存在于多种中药植物中，是一种具有天然生物活性的甾体化合物，多项研究表明，β谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗菌、调节免疫系统等生物活性[14-15]。β谷甾醇还可调节骨代谢平衡，曾莉萍等[16]发现杜仲叶提取物β谷甾醇可使成骨细胞护骨素与破骨细胞分化因子的比值增高，不仅直接促进成骨作用，而且通过有效地抑制破骨作用协同达到护骨效果。因此推测香加皮可通过自身有效成分的抗炎、调节免疫、促进成骨等药理作用在治疗牙周炎疾病中发挥疗效。
本研究通过PPI网络分析筛选得到TNF、IL6、MAPK3、STAT3、JUN、CASP3、HIF1A、MMP9、PTGS2、MTOR十个关系最为密切的核心靶点。PTGS2在炎性介质形成过程中具有重要启动作用。TNF-α与IL6是牙周炎发展过程中两种重要的促炎因子，有研究发现，IL6、TNF-α与牙周组织破坏程度呈明显的正相关，二者均可促进破骨细胞分化因子（RANKL）的表达诱导破骨细胞形成，导致牙槽骨吸收破坏[17]。MMP9是人体重要的基质金属蛋白酶之一，可降解牙龈、牙周膜和牙槽骨的细胞外基质，在牙周炎发生发展过程中起着重要作用[18]。MAPK是一种广泛存在于胞浆内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在牙周组织抗炎反应、牙槽骨的破坏与形成中具有重要作用[19]。细胞凋亡可能是调节炎症反应对抗慢性细菌感染的重要途径，从而影响细胞增殖和炎症浸润的程度。CASP3是一种在细胞凋亡过程中被激活的关键蛋白酶[20]。MTOR作为PI3K-Akt通路的下游分子，能够刺激细胞的增殖和分化，同时也能抑制成骨细胞凋亡与自噬[21]。长期慢性炎症会引起牙周组织发生微循环障碍、血流低灌注，从而导致牙周组织低氧微环境形成。而在缺氧条件下，HIF1A在调节细胞凋亡、自噬、牙槽骨的吸收以及牙周组织的血管生成等方面发挥重要作用[22]。表明香加皮可通过以上核心靶点经不同途径调控相关炎症因子，参与调节细胞免疫、成骨、破骨、成血管、细胞增殖、分化、凋亡、自噬等多途径，从而干预治疗牙周炎。
GO富集分析显示，香加皮治疗牙周炎的靶基因主要涉及炎症反应、细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应等生物学过程。说明香加皮有效成分可作用于关键靶点调控宿主对牙周致病菌脂多糖的反应，并通过影响多种细胞因子水平调控重要信号通路，从而干预机体的炎症反应。KEGG信号通路富集分析结果提示香加皮可能通过TNF、细胞凋亡、IL17等信号通路治疗牙周炎。牙周致病菌可诱导炎症反应的发生，导致TNF-α表达上调，活化TNF信号通路并诱导多种效应分子表达增加，从而实现白细胞募集、炎症级联放大等效应，这些炎症因子促进破骨、抑制成骨，参与牙周组织的破坏[23]。IL17为辅助性T细胞17分泌的细胞因子，可作为前炎症因子诱导多种促炎因子的分泌，并与这些细胞因子发挥协同作用，放大炎症反应[24]。此外，慢性炎症组织中的IL17可通过激活MMPs表达以及成骨细胞上RANKL的表达，在牙槽骨的破坏中发挥作用[25]。Pacheco等[26]的研究中发现通过抑制牙周组织中IL17A活性，可以明显减少牙槽骨的吸收，抑制破骨细胞的活性，同时也降低了IL6的表达。牙周炎患者牙周组织中IL17水平远高于正常牙周组织，表明IL17是牙周炎发生过程中的重要促炎性因子。在对从杠柳中提取的杠柳苷A的研究中发现，其抗炎机制与阻止IL17生成及抑制Th17细胞分化有关[27]。通过分子对接发现配体与受体的结合能均为负值，且欧奕二烯酮A、杠柳毒苷元、杠柳次苷等成分与关键作用靶点之间均具有较好结合活性，初步验证了香加皮主要成分与核心靶点的结合可能是其发挥作用的关键。
本研究结果与相关研究均表明，香加皮的有效成分可通过作用于多个关键靶点对多条核心通路产生调控作用。通过发挥抗炎、抗菌作用控制局部感染，减轻局部炎症反应；
通过调节细胞免疫以及骨代谢平衡减轻牙周骨组织破坏，促进牙周组织再生；
通过调控多种细胞因子，改善局部微环境，调控局部组织细胞增殖、凋亡、自噬等细胞进程等多方面作用在治疗牙周炎疾病中发挥疗效。
综上所述，本研究借助网络药理学方法揭示了香加皮治疗牙周炎的分子学机制，结果表明香加皮可通过多成分、多靶点、多通路的协同作用治疗牙周炎。并且本研究利用分子对接方法初步验证了香加皮有效成分与其治疗牙周炎潜在靶点的结合效果，为探索香加皮治疗牙周炎的药理作用奠定了基础，也为开展香加皮的临床应用和研究提供了参考。
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