葫芦巴改善瘦素缺陷型ob/ob小鼠炎症及胰岛素抵抗的机制研究*
时间：2022-12-07 12:55:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
周 聪 沈 霖 陈 瑞 胡 曼 卢芙蓉
华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉 430022
近些年来肥胖的发病率在全球范围内急剧增加，肥胖与各种疾病密切相关，包括心血管疾病[1]、2型糖尿病[2]、高血压、血脂异常[3]、肝脏疾病以及癌症[4]等。研究[5]表明，肥胖通常表现为慢性低度炎症并伴随着胰岛素抵抗。本课题组前期研究[6-9]表明，葫芦巴提取物4-羟基异亮氨酸在体外可通过抑制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和肿瘤坏死因子转化酶(TNF converting enzyme，TACE)的活性来改善3T3-L1脂肪细胞和HepG2肝细胞的胰岛素抵抗，而葫芦巴在体内是否仍可对肥胖相关炎症和胰岛素抵抗发挥改善作用还有待验证。本研究通过建立肥胖小鼠模型，观察葫芦巴治疗对于炎症因子、胰岛素受体和JNK信号通路等的影响，探讨葫芦巴治疗肥胖的可能机制。
1.1 实验动物
20只雄性C57BL/6J小鼠(3周龄，17～18 g)，20只雄性瘦素缺陷型ob/ob小鼠(3周龄，18～19 g)均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，所有动物饲养于华中科技大学动物实验中心。
1.2 葫芦巴汤剂的制备
将干燥的葫芦巴种子磨成粉末，在蒸馏水中浸泡后煮沸。过滤器分离沉淀物，获得葫芦巴汤剂。
1.3 实验分组及喂养、给药方式
适应性饲养1周后，将C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组(NC组)和高脂饮食组(HFD组)，每组各10只：NC组小鼠喂养正常饲料，HFD组小鼠喂养高脂饲料。
将瘦素缺陷型ob/ob小鼠随机分为葫芦巴低剂量治疗组(Fenu/L组)和葫芦巴高剂量治疗组(Fenu/H组)，每组各10只：Fenu/L组小鼠喂养正常饲料，12周后每天灌服低剂量葫芦巴汤剂(0.1 mL/只)，持续12周；
Fenu/H组小鼠喂养正常饲料，12周后每天灌服高剂量葫芦巴汤剂(0.2 mL/只)，持续12周。
1.4 血清和脂肪样本获取
小鼠禁食过夜，通过腹主动脉穿刺获得血液1 mL，离心后取上清液在-20 ℃下保存。同时，分离皮下白色脂肪组织，在-80 ℃下保存。
1.5 观察指标
1.5.1 血脂测定 采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平。
1.5.2 胰岛素抵抗指数计算 采用手持血糖仪测量空腹血糖，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测空腹血清胰岛素。
胰岛素抵抗指数(insulin resistance index of homeostasismodel assessment，HOMA-IR)应用自身稳态模型评估法进行计算，HOMA-IR =(空腹血糖×空腹血清胰岛素)/22.5。
1.5.3 炎症因子(IL-1β和IL-6)和趋化因子(MCP-1)测定 采用ELISA试剂盒测量血清中IL-1β、IL-6和MCP-1蛋白水平。
采用RT-qPCR检测皮下脂肪组织中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达水平。使用总RNA抽提试剂(Trizol)从皮下脂肪组织中提取总RNA，通过反转录将RNA转化为cDNA。然后在PCR仪器进行扩增，95°C 10分钟，95°C 30秒，60°C 30秒，40个循环。采用2-ΔΔCt方法进行分析计算，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参。引物序列见表1。
表1 用于RT-qPCR的引物序列
1.5.4 脂肪组织中胰岛素受体和JNK信号通路测定 采用放射免疫沉淀试验(radio immunoprecipitation test，RIP)裂解液从皮下脂肪组织样品中提取总蛋白。将蛋白质样品上样5%或12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)中，然后转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。将PVDF膜浸入含有5%脱脂奶粉的Tris Buffered Saline+Tween(TBST)缓冲液中，摇床封闭2 h，然后与特定的一抗在4 °C下孵育过夜。将PVDF膜浸入二抗孵育溶液中。洗涤后，将增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂和稳定的过氧化物酶溶液以1：1的比例混合显色，通过iBright智能成像系统获取图片。
1.6 统计学方法
采用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 7软件进行绘图。组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 体重比较
喂养12周后，HFD组、Fenu/L组、Fenu/H组小鼠体重均显著高于NC组(P<0.05)，Fenu/L组、Fenu/H组小鼠体重显著高于HFD组(P<0.05)。
经过12周葫芦巴治疗后，Fenu/H组小鼠体重显著低于HFD组、Fenu/L组(P<0.05)。见表2。
表2 各组小鼠体重比较
2.2 血清TC、TG、LDL、HDL水平比较
HFD组小鼠血清TC、TG和LDL水平显著高于NC组(P<0.05)，HDL水平显著低于NC组(P<0.05)。
经过12周葫芦巴治疗后，Fenu/L组、Fenu/H组小鼠血清TC、TG和LDL水平显著低于HFD组(P<0.05)，HDL水平显著高于HFD组(P<0.05)；
且Fenu/H组小鼠血清TC、LDL水平显著高于Fenu/L组(P<0.05)。见表3。
表3 各组小鼠TC、TG、LDL、HDL水平比较
2.3 空腹血糖、空腹血清胰岛素、HOMA-IR水平比较
HFD组小鼠空腹血糖、空腹血清胰岛素和HOMA-IR水平显著高于NC组(P<0.05)。
经过12周葫芦巴治疗后，Fenu/L组、Fenu/H组小鼠空腹血糖、空腹血清胰岛素和HOMA-IR水平显著低于HFD组(P< 0.05)；
且Fenu/H组小鼠空腹血清胰岛素和HOMA-IR水平显著低于Fenu/L组(P< 0.05)。见表4。
表4 各组小鼠空腹血糖、空腹血清胰岛素、HOMA-IR水平比较
2.4 血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平比较
HFD组小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平显著高于NC组(P<0.05)。
经过12周葫芦巴治疗后，Fenu/L组、Fenu/H组小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平显著低于HFD组(P<0.05)，且Fenu/H组小鼠血清IL-1β、IL-6水平显著低于Fenu/L组(P<0.05)。见表5。
表5 各组小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平比较
2.5 皮下脂肪组织IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相对表达水平比较
HFD组小鼠皮下脂肪组织中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相对表达水平均显著高于NC组(P<0.05)。
经过12周葫芦巴治疗后，Fenu/L组、Fenu/H组小鼠皮下脂肪组织中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相对表达水平均显著低于HFD组(P<0.05)，且Fenu/H组显著低于Fenu/L组(P<0.05)。见表6。
表6 各组小鼠皮下脂肪组织IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相对表达水平比较
2.6 皮下脂肪组织p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4和c-JUN、p-c-JUN、JNK、p-JNK蛋白表达比较
HFD组小鼠皮下脂肪组织中c-JUN、p-c-JUN、JNK和p-JNK的蛋白表达水平高于NC组，p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4的蛋白表达水平低于NC组。
经过12周葫芦巴治疗后，Fenu/L组、Fenu/H组小鼠皮下脂肪组织中c-JUN、p-c-JUN、JNK和p-JNK的蛋白表达水平低于HFD组，p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4的蛋白表达水平高于HFD组。见图1。
图1 各组小鼠皮下脂肪组织p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4和c-JUN、p-c-JUN、JNK、p-JNK蛋白表达电泳图
瘦素为肥胖基因(obese，ob)编码产物，是脂肪细胞分泌的蛋白质类激素，在调节能量平衡、摄食行为方面起重要作用。瘦素缺陷型ob/ob小鼠是一种由于ob基因的纯合子自发隐性突变而无法表达和分泌具有正常功能瘦素的遗传性小鼠，在1950年由Ingalls成功繁育[10]。瘦素缺陷型ob/ob小鼠表现为食欲大增，体重剧增，产生严重的肥胖特征，是研究肥胖疾病的理想模型[11]。C57BL/6J小鼠通过高脂饲料连续干预12周可建立肥胖小鼠模型。
肥胖表现为一种低度的持续性炎症状态，在不同的代谢组织中引起氧化应激，从而导致胰岛素抵抗。肥胖的炎症状态是由免疫细胞(包括脂肪组织巨噬细胞和T细胞)向代谢组织的浸润增加导致[13]。在肥胖人群中，脂肪组织巨噬细胞被称为M1型巨噬细胞，它释放促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α，创造一个阻止脂肪细胞对胰岛素作用的促炎环境，从而导致胰岛素抵抗的发生[14]。
趋化因子是一类能趋化细胞定向移动的小分子分泌蛋白，MCP-1属于趋化因子家族的一个小细胞因子。MCP-1主要通过受体CC趋化因子受体(chemokine c-c-motif receptor，CCR)2实现其生物学效应，可以激活不同的信号转导通路，例如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)途径等[15]。
胰岛素抵抗的特征主要表现为胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)-1/PI3K/Akt途径磷酸化水平降低从而导致胰岛素信号传导减少。脂肪组织巨噬细胞分泌的促炎细胞因子(例如IL-1β、IL-6和TNF-α)可激活胰岛素靶细胞内炎症的关键调节因子，例如JNK。在肥胖条件下，JNK的激活会刺激促炎性转录因子，包括核转录因子(nuclear transcription factor，NF)-κB，从而导致胰岛素受体底物的丝氨酸磷酸化，继而干扰胰岛素的作用。
本研究结果发现，葫芦巴可减轻ob/ob小鼠体重，并调节血脂，具有良好的抗肥胖作用；
葫芦巴可通过抑制炎症因子(IL-1β、IL-6)及趋化因子(MCP-1)表达、限制JNK炎症信号通路的激活而表现出抗炎特性，也可通过降低空腹血糖、空腹血清胰岛素、HOMA-IR水平并诱导胰岛素受体信号通路的激活而表现出明显的改善胰岛素抵抗效应。
综上所述，葫芦巴具有良好的治疗肥胖和改善胰岛素抵抗作用，可能是通过调节炎症因子(IL-1β和IL-6)及趋化因子(MCP-1)，并抑制JNK信号通路的激活，最终实现其抗炎和改善胰岛素抵抗的双重功效。
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