重组ProTα诱导肝癌细胞自噬的作用及机制
时间：2022-12-05 22:20:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
栗 华 高艺萍 陈 观 吴 娜
1.厦门大学附属第一医院消化内科，福建 厦门 361003；
2.福建医科大学临床医学部，福建 福州 350122
胸腺素原α（prothymosinα，ProTα）具有多种生理功能，如促进白介素（interleukin，IL）-2、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的分泌；
促进IL-2 受体的表达，从而产生非特异性肿瘤杀伤作用；
同时，可诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞（CD8+）和辅助性T 细胞（CD4+）的特异性抗肿瘤作用[1-2]。先前研究发现ProTα 抗肿瘤作用远强于胸腺素α1[3]；
许多细胞因子可以调节自噬的发生，其中包括IFN-γ、TNF-α、IL-10 和IL-12等[4-5]。近期研究发现，TACE 联合胸腺素α1 可明显增加中晚期原发性肝癌患者免疫细胞自噬水平[6]。推测ProTα 抗肿瘤作用除了可以调节免疫外，还能诱导肿瘤细胞的自噬性死亡发挥抗肿瘤作用。为此，本研究观察了ProTα 对HepG2 细胞和H22 肝癌荷瘤小鼠癌细胞自噬作用的影响，并初步探讨其可能机制。
1.1 材料
本研究经厦门大学实验动物伦理委员会审核批准。ProTα（厦门大学生态与环境学院周克夫教授与厦门伯赛基因转录技术有限公司联合制备，浓度：1.3 mg/ml ）；
奥沙利铂（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20093487，规格：50 mg/支）；
HepG2 细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所）；
抗p-mTOR；
P62 一 抗（BD Biosciences 公 司）；
抗β-actin 一 抗（美 国Sigma 公 司）；
Human IFNgamma/γ-IFN Protein（北京义翘神州科技股份有限公司）；
抗LC3B 抗体（ab63817，英国abcam 公司）；
ZB-5305 辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 及ZB-5301 辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；
CCK-8 试剂盒（Dojindo 日本同仁化学研究所）。
动物与瘤株：肿瘤H22（小鼠肝癌）细胞株（厦门大实验动物中心）；
昆明小鼠，S P F 级，4 周龄，体重20 ～25 g，雄性（厦门大学实验动物中心）。
1.2 方法
1.2.1 CCK-8 法测定ProTα、IFN-γ 作用后HepG2细胞的存活率 取对数生长期的HepG2 细胞，以5.0×103个/ 孔的细胞密度接96 孔板中，培养24 h 待HepG2 细胞贴壁后，分别加入不同浓度（40、100、400 ng/ml） 的ProTα、IFN-γ（100 ng/ml）进行药物处理，24、48 h 后分别进行CCK-8 检测。每个浓度设4 个孔同时设不加药的对照组和只加培养液的空白组。检测时加入CCK-8 溶液10 μl/ 孔细胞继续培养2 h 后，在酶标仪波长450 nm 处检测各孔的吸光度（D）值（重复3 次），并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（D 实验组值-D空白组值）/（D 对照组值-D 空白组值）×100%。
1.2.2 H22 荷瘤小鼠建立、分组及干预 抽取生长于小鼠腹腔中的H22 肿瘤腹水，用细胞计数板计数后稀释至1×107个/ml，将H22 肝癌肿瘤细胞接种于50 只雄性昆明小鼠右前肢外侧，每只小鼠接种100 μl，即每只小鼠接种106个细胞，1 周后筛选出肿瘤直径＞2 mm 的小鼠40 只，随机数表法分为四组，每组各10 只，对照组、ProTα 组、奥沙利铂组、ProTα+奥沙利铂组，小剂量奥沙利铂（2.5 mg/kg）腹腔注射2 周，隔日一次，共注射6 次，ProTα（40 ng/g）腹腔注射2 周，隔日一次，共7 次。利用苦味酸对小鼠进行标记，隔3 d 称重一次，对照组给予等体积生理盐水。实验过程中若有小鼠死亡，记录其死亡时间并留存肿瘤标本。
1.2.3 肿瘤质量、抑瘤率、胸腺指数计算 给药期间观察小鼠生存情况，末次给药后24 h 称重，脱颈法处死所有小鼠，剥离瘤体，修剪杂质后称取瘤重，抑瘤率=（模型组瘤重-干预组瘤重）/模型组瘤重×100%；
取胸腺称重，胸腺指数=胸腺质量（mg）/体重（g）。
1.2.4 Western blot 法检测自噬相关LC3B、P62 及p-mTOR 蛋白表达 取肿瘤组织，液氮研磨后，TRIzol 法提取总蛋白。经过上样、SDS 电泳、转膜，5% 脱脂奶粉封闭。分别加入稀释后的兔抗鼠LC3B、P62、p-mTOR 单克隆抗体，4℃孵育过夜。洗膜，加入1 ∶1000 的带有荧光标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h。洗膜，ECL 发光法显色，以β-actin 作为内参，采用GIS1000 分析软件检测蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。
2.1 细胞学实验
CCK-8 结果显示，不同浓度（40、100 、400 ng/ml）的ProTα对HepG2细胞存活率的影响与对照组比较，差异无统计学意义（浓度40 ng/ml：t=1.892，P＞ 0.05；
浓度100 ng/ml：t=1.903，P＞ 0.05；
浓度400 ng/ml：t=1.897，P＞ 0.05）。100 ng/ml IFN-γ 处理HepG2细胞24、48 h，HepG2 细胞的存活率分别降低61.03%、52.16%，与对照组比较，抑制作用明显增加，差异有统计学意义（24 h：t=6.861，P＜ 0.01；
48 h：t=8.496，P＜ 0.01）。见图1。同时发现自噬标记物LC3B 蛋白水平显著增加，与对照组相比，差异有统计学意义（24 h 组：t=5.144，P＜ 0.01；
48 h 组：t=6.322，P＜ 0.01），结果提示IFN-γ 可以诱导肝癌HepG2 细胞的自噬活性，见图2。
图1 给予100 ng/ml IFN-γ 24、48 h 后肝癌HepG2 细胞生长曲线
2.2 小鼠一般情况
随移植瘤的生长，各组小鼠的活动均减少，攻击性降低，精神萎靡，进食、饮水减少，毛发无光泽易脱落，奥沙利铂组小鼠表现最明显。
2.3 各组小鼠肿瘤质量、抑瘤率及胸腺指数比较
与对照组比较，各干预组肿瘤质量较小（P＜ 0.05）；
ProTα 可明显降低H22 实体瘤小鼠的肿瘤质量（t=3.006，P＜ 0.05），抑瘤率达34.7%；
ProTα+奥沙利铂组抑瘤率高于ProTα 组（t=3.504，P=0.003），但与奥沙利铂组比较，抑瘤率虽有提高，但差异无统计学意义（t=1.695，P=0.107）；
与对照组及奥沙利铂组比较，ProTα 和ProTα+奥沙利铂组胸腺指数较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。
表1 各组小鼠肿瘤质量、抑瘤率、胸腺指数比较（x ± s）
2.4 各组H22荷瘤小鼠瘤组织中自噬调控蛋白LC3B、P62及p-mTOR蛋白表达水平比较
与对照组比较，ProTα 组、奥沙利铂组和ProTα+奥沙利铂组小鼠瘤组织中LC3B 蛋白表达均升高（P＜ 0.05），ProTα 组、奥沙利铂组和ProTα+奥沙利铂组小鼠瘤组织中P62 及p-mTOR表达均明显下降（P＜ 0.05），尤其是ProTα+奥沙利铂组下降更加显著，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 2、图 2 ～ 3。
表2 各组H22荷瘤小鼠瘤组织中LC3B、P62及p-mTOR蛋白表达量比较（x ± s）
图2 各组LC3B、P62 蛋白表达Western blot 电泳
图3 各组p-mTOR 蛋白表达Western blot 电泳
奥沙利铂是晚期胃肠肿瘤治疗的新一代细胞毒药物。研究表明，含奥沙利铂的TACE 治疗方案可明显延长晚期肝癌患者生存时间。但常规剂量奥沙利铂也容易引起骨髓抑制及肾功能损害。因此，寻找有效的联用药物，降低不良反应、提高奥沙利铂临床利用率及疗效非常重要。
自噬与凋亡是细胞程序性死亡的两种不同类型，两者共同维持生物体内稳态，对肿瘤细胞的生存和死亡也有非常重要作用。研究发现，很多分子或蛋白是通过调节自噬抑制肿瘤细胞的增殖发展[7]。当哺乳动物细胞发生自噬时，细胞内LC3A 向LC3B转化明显增加。LC3 是自噬过程的标记蛋白之一，参与自噬全过程，在自噬体形成过程中，位于自噬体内的胞浆型LC3，即LC3A 与磷脂酰乙醇胺结合转换成膜型LC3B，并由自噬体膜内转移到膜上。因此，LC3B 与自噬体的数量更加密切。因此利用Western blot 检测LC3B 蛋白的水平，可反映细胞内自噬体数量的变化[8]。p62 是自噬的选择性作用靶点，p62 蛋白表达水平可以反映自噬降解能力[9]，即自噬活性增高可导致p62 减少。近年来常将其作为自噬活性检测指标。此外，许多细胞因子可以调节自噬的发生，其中包括IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-12 等[10-12]。ProTα 可 促 进IL-2、IFN-γ、MIF 的分泌，产生非特异性肿瘤杀伤作用[4-5]。同时，ProTα 可诱导肿瘤特异性CD8+和CD4+特异性抗肿瘤作用；
并发现ProTα 的抗肿瘤作用远强于胸腺素α1[13]。前期研究发现[14]，具有自主知识产权的重组ProTα 通过下调Treg 细胞、上调NKG2D 阳性细胞比例发挥显著的抑瘤效应。本研究发现，各种浓度的ProTα 对HepG2 细胞无直接抑制作用，然而，与对照组比较，IFN-γ 抑制HepG2 细胞增殖作用明显增加，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。同时发现自噬标记物LC3B 蛋白水平显著增加（P＜ 0.05），提示IFN-γ 可以抑制HepG2 细胞的生长，并诱导肝癌HepG2 细胞的自噬活性。而实验动物研究也表明，ProTα 可明显提高胸腺指数，降低H22 实体瘤小鼠的瘤质量系数，抑瘤率达34.7%，进一步证实ProTα 具有增强小鼠免疫功能的作用。本研究结果说明ProTα 抑瘤作用非直接抑制H22 肿瘤细胞增殖，而是通过调节机体免疫细胞发挥抗肿瘤作用。同时本研究表明，重组ProTα 可显著上调瘤组织中自噬相关LC3B 蛋白的表达，下调P62 及p-mTOR 蛋白的表达。以上研究结果表明，ProTα可以通过免疫调节作用抑制H22 荷瘤小鼠肿瘤组织生长，并可能通过促进淋巴细胞分泌IFN-γ 诱导H22 荷瘤小鼠肿瘤细胞自噬抑制肿瘤细胞增殖发挥抗肿瘤作用。
此外，本研究发现ProTα 在体内联合奥沙利铂与单独使用ProTα 或奥沙利铂相比，对H22 具有更强的抗肿瘤细胞增殖作用，提示联合用药组显示出了更明显的优势。mTOR 是细胞自噬的负性调控因子，可抑制自噬的发生。有研究表明，抑制p-mTOR 可促进HeLa 细胞、肝癌细胞HepG2等自噬[15]，Western blot 检测发现，相对于对照组，ProTα 在体内联合奥沙利铂或单独使用ProTα 可上调LC3B 及下调P62 及p-mTOR 蛋白表达。说明ProTα 联合奥沙利铂给药可能是通过诱导肝癌自噬抑制肿瘤生长，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR 通路相关。
综上所述，ProTα 作为一种免疫调节药物，可通过调节免疫细胞释放IFN-γ 等细胞因子下调p-mTOR 表达诱导自噬发挥抗肿瘤作用；
ProTα 可提高奥沙利铂的抗癌疗效，为ProTα 进一步开展临床研究和开发奠定了一定基础。
