复方钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠的药效作用及物质基础*

陈春茗，刘叶倩，陈 蕾，赵红霞，李 弘，任卫琼

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；
2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；
3.安徽省第二人民医院，安徽 合肥 230041）

复方钩藤降压解郁方是以经典方“天麻钩藤饮”为基础方化裁而成，由钩藤、天麻、川芎、地龙、杜仲、桑寄生、丹参、白芍、贯叶连翘、葛根10味中药组成，具有养阴平肝、化瘀解郁的作用，可用于高血压并发抑郁症的治疗，但其药效和活性成分缺乏系统研究。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术具有快速、准确、全面的特点，近年来广泛用于中药复方化学成分的分析。本研究从药理学和药物分析学两个角度研究复方钩藤降压解郁方，综合分析了此方的主要化学成分并揭示了其药效作用，以期为后续复方钩藤降压解郁方的二次开发和临床应用奠定基础。

1.1 实验动物8周龄SPF级雄性SHR大鼠20只，体质量180～220 g，收缩压180～200 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa），购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证编号：1100112 11113502636，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006。8周龄SPF级雄性SD大鼠10只，体质量180～220 g，购自湖南安生美药物研究院有限公司，质量合格证编号：430727211102773234，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。以上大鼠饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心SPF级实验动物房中，饲养条件：温度20～25℃，湿度40%～70%，12 h明暗交替，适应性饲养7 d。动物使用许可证号：SYXK（湘）2020-0010。伦理委员会审批号：2YFY20210316-01。

1.2 药物与试剂复方钩藤降压解郁方购于湖南中医药大学第一附属医院，由钩藤、天麻、川芎、地龙、杜仲、桑寄生、丹参、白芍、贯叶连翘、葛根10味中药组成，药材经该院张裕民主任中药师鉴定均符合2020年版《中华人民共和国药典》的质量要求。异钩藤碱对照品（批号：111927-201804，纯度＞98%）、钩藤碱对照品（批号：112028-201601，纯度＞98%）均购于中国食品药品检定研究院；
芍药内酯苷对照品（批号：20200419，纯度＞98%）、芍药苷对照品（批号：107D021，纯度＞98%）均购于北京索莱宝科技有限公司；
葛根素对照品（批号：21090805，纯度＞98%）、隐丹参酮对照品（批号：21091603，纯度＞98%）、洋川芎内酯A对照品（批号：21080506，纯度＞98%）均购于成都普菲德生物技术有限公司；
色谱甲醇、质谱乙腈均购于德国Merck Millipore公司；
蒸馏水购于深圳屈臣氏蒸馏水有限公司；
甲酸铵（质谱级）购于美国Fisher公司。

1.3 主要仪器YLS-9A型生理、药理电子刺激仪（济南益延科技发展有限公司）；
BP-98A型智能无创血压计（北京软隆生物技术有限公司）；
MK3型酶标仪（美国Thermo-fisher公司）；
Agilent 1290UPLC-6540 Q-TOF色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；
超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；
S-23型高速台式离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；
AUW120D电子分析天平（日本SHIMADZU公司）。

2.1 动物实验

2.1.1 药液的制备 将复方钩藤降压解郁方16剂（94 g/剂）药物（除钩藤外）置于煎药器中，浸泡30 min，加水煎煮1 h，钩藤后下，第2次加水煎煮40 min，合并药液后过滤，用旋转蒸发仪浓缩成复方钩藤降压解郁方干膏289.6 g。将复方钩藤降压解郁方干膏用蒸馏水溶解并稀释成质量浓度为0.846 g/mL药液，冷藏备用。

2.1.2 造模与分组 造模方法按照前期研究建立的方法[1]，将20只SHR大鼠，按随机数字表法分为模型组、复方钩藤降压解郁方组，每组10只。10只SD大鼠为正常对照组。除正常对照组外，其余两组大鼠每天进行不可预知慢性应激刺激：（1）噪声4 h；
（2）禁水24 h；
（3）禁食24 h；
（4）昼夜颠倒24 h；
（5）潮湿垫料24 h；
（6）4℃冰水浴4 min；
（7）倾笼45° 24 h；
（8）夹尾1 min。每种刺激方法每天随机抽取进行干预，方法（6）、（8）每周1次，且1周内的干预方法不重复。

2.1.3 实验给药 根据《中药药理研究方法学》[2]，按体表面积折算大鼠的等效给药剂量，大鼠每日用药量为8.46 g/kg，正常对照组和模型组大鼠给予等体积蒸馏水，1次/d，连续给药28 d。

2.1.4 观察指标

2.1.4.1 各组大鼠血压变化情况 用BP-98A智能无创血压计在给药前和给药后第1、2、3、4周分别测量各组大鼠血压值（给药后1 h尾动脉收缩压的平均值即为该只大鼠所在周的血压值）。

2.1.4.2 行为学检测 通过Open-field实验、新奇摄食实验和糖水偏好实验观察各组大鼠抑郁行为、认知功能等的变化。

Open-field实验是在弱光和低噪声环境下，将大鼠单独置于黑色正方形旷场中央，旷场装置是100 cm×100 cm×40 cm的木制箱，内侧面及底部均为黑色，底部漆成横竖各3条白线。旷场实验时间为5 min，将小鼠放入中心方格内，摄像记录大鼠5 min内穿越格数（水平运动）和前肢离地成攀壁的直立次数（垂直运动），直立计数要求双脚抬起。水平运动1格计1分，直立1次计1分。每只大鼠接受1次测试，测试完毕后捡拾粪便，用75%的医用酒精喷洒旷场底部及内侧壁，用干毛巾擦拭，待其挥发后进行下一只的操作，以避免上只实验大鼠留有气味而干扰实验结果。

新奇摄食实验是使用顶部开放的白色不透明树脂测试箱，底部铺满约2 cm厚的垫料，在中央摆放6粒饲料颗粒。禁食24 h后，将大鼠从同一个角落放入箱中并开始计时，以开始咀嚼食物为标准记录所用时间，定义为摄食潜伏期。测试共计5 min，5 min内未进食者摄食潜伏期记录为5 min。

糖水偏好实验是在大鼠适应性训练后，禁食禁水24 h，各笼备蔗糖水与蒸馏水各一瓶，每瓶200 mL，供大鼠自由饮用，1 h后调换二者位置，2 h后撤除水瓶，记录2 h内蔗糖水瓶糖水消耗量。计算糖水偏爱率（%）=（糖水消耗/液体总计消耗）×100%。

2.1.4.3 炎症因子指标检测 实验结束后，各组大鼠禁食不禁水处理12 h，10%水合氯醛麻醉后取脑，于冷冻操作台上分离海马组织，经液氮急速冷冻后，保存于-80℃冰箱。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测大鼠海马组织中IL-1β、IL-6的含量。

2.1.5 统计学方法 数据采用IBM SPSS Statistics 21.0软件处理，计量资料用（±s）表示，多组间比较服从正态分布且方差齐，采用单因素方差分析，两两比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。用GraphPad Prism 7制作柱状图。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

2.2.1 对照品和供试品溶液的制备

2.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、异钩藤碱、钩藤碱、洋川芎内酯A和隐丹参酮对照品各2 mg，置于10 mL的容量瓶中，用70%甲醇溶解，稀释至刻度，并用0.22 μm微孔滤膜过滤，各吸取0.1 mL于进样瓶中，即得对照品溶液。

2.2.1.2 供试品溶液的制备 取2 g干膏，置于50 mL锥形瓶中，加70%甲醇50 mL，超声处理30 min，冷却，补加70%甲醇后离心，并用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.2 色谱及质谱条件 色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流动相由有机相乙腈（A）和水相（B）组成，其中水相B中含0.05 mmol/L甲酸铵（质谱级），设置梯度洗脱程序：0～5 min，5%～15%A；
5～10 min，15%～35%A；
10～20min，35%～65%A；
20～25min，65%～95%A；
流速：0.4 mL/min，进样量：1 μL。

质谱检测条件：采用正负离子分析模式，离子化方式为电喷雾离子化（ESI），进样分析前采用Agilent标准调谐液ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）来进行准确质量数的校正。一级质谱扫描检测检测范围（m/z）：100～1 700，采用氮气为除溶剂干燥气体，温度为325℃，流速为6.8 L/min；
鞘气温度为350℃；
毛细管电压为4.0 kV，Fragment电压为150V。

3.1 动物实验

3.1.1 各组大鼠血压变化比较 与正常对照组比较，模型组大鼠血压在给药前和给药后第1、2、3、4周均明显升高（P＜0.01），提示模型制备成功。与模型组比较，复方钩藤降压解郁方组大鼠血压在给药后第1、2、3、4周均明显降低（P＜0.01），说明复方钩藤降压解郁方可以很好地抑制高血压并发抑郁症模型大鼠的血压。（见图1）

图1 各组大鼠血压变化比较（±s，n=10）

3.1.2 行为学检测结果 与正常对照组比较，模型组大鼠自主活动（水平运动、垂直运动）明显减少，摄食潜伏期明显延长，糖水偏好程度明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），说明模型大鼠在行为学上明显出现了抑郁样改变，提示造模成功。与模型组比较，复方钩藤降压解郁方组大鼠自主活动能力（水平运动、垂直运动）明显增多，摄食潜伏期明显缩短，糖水偏好程度明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（见图2～4）

图2 各组大鼠自由活动次数比较（±s，n=10）

图3 各组大鼠摄食潜伏期比较（±s，n=10）

图4 各组大鼠糖水偏好程度比较（±s，n=10）

3.1.3 各组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6的含量比较 与正常对照组比较，模型组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6的水平均明显升高（P＜0.05）；
与模型组比较，复方钩藤降压解郁方组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6的水平均明显降低（P＜0.05）。（见图5）

图5 各组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6水平比较（±s，n=10）

3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

3.2.1 主要色谱峰的鉴定以及化合物的药材来源 通过中国科学院化学数据库（www.organchem.csdb.cn）以及文献分析，初步构建复方钩藤降压解郁方10味中药化学成分数据库，共检索到1 768个化学成分，其中钩藤106个、天麻170个、川芎113个、地龙83个、杜仲206个、桑寄生166个、丹参225个、白芍85个、贯叶连翘311个、葛根303个。

利用UPLC-Q-TOF-MS分析方法，从复方钩藤降压解郁方中快速鉴定出化合物51个，包括黄酮类9个、糖苷类7个、苯丙素类1个、二萜类5个、生物碱类11个、酚酸及其酯类2个、氨基酸类2个、其他类14个，并对每个化合物的来源进行了归属。复方钩藤降压解郁方UPLC-Q-TOF-MS正、负离子流图及对照品图谱见图6～7，复方钩藤降压解郁方化学成分的保留时间、质荷比、误差、分子式、化合物名称、碎片离子信息、药材来源等信息数据见表1。

表1 复方钩藤降压解郁方化学成分质谱信息

图6 复方钩藤降压解郁方UPLC-Q-TOF-MS总离子流图

3.2.2 各种化合物的结构和裂解

3.2.2.1 生物碱类化合物 化合物26：复方钩藤降压解郁方中的生物碱类化合物主要来自钩藤。正离子模式下，ESI－MS准分子离子峰为（m/z）385.209 8[M+H]+，tR为17.458 min，分子式为C22H28N2O4，碎片离子峰为160.074 7，187.082 1，241.132 5，269.163 2，353.185 5。分别对应[M+H-C12H19NO3]+，[M+HC11H18O3]+，[M+H-C7H10O3]+，[M+H-C5H8O3]+，[M+H-CH2O]+。通过对照品比对，鉴定化合物26为异钩藤碱。（见图8～9）

图7 对照品UPLC图谱

图8 异钩藤碱碎片离子图

图9 异钩藤碱可能的裂解过程

3.2.2.2 黄酮类化合物 化合物18、21：复方钩藤降压解郁方中的黄酮类化合物主要来自葛根。峰21和18的准分子离子峰均为（m/z）417[M+H]+，峰18质谱图的碎片离子为（m/z）255[M+H-Glu]+，推测可能是大豆苷。峰21质谱图的碎片离子为（m/z）381[M+H-2H2O]+，297[M+H-H2O-C4H6O3]+，根据对照品对照，鉴定为葛根素。（见图10～13）

图10 大豆苷碎片离子图

图11 大豆苷可能的裂解途径

图13 葛根素可能的裂解途径

3.2.2.3 二萜类化合物 化合物50：复方钩藤降压解郁方中的二萜类化合物主要来自丹参。如图14所示，化合物50，保留时间为38.922 min，分子式为C19H18O3，在正离子模式下得到（m/z）295[M+H]+，280[M+H-CH3]+，277[M+H-H2O]+，266[M+H-CHO]+，262[M+H-H2O-CH3]+，249[M+H-H2O-CO]+的碎片离子，推测该化合物为丹参酮ⅡA，其裂解途径见图15。

图12 葛根素碎片离子图

图14 丹参酮ⅡA碎片离子图

图15 丹参酮ⅡA可能的裂解途径

高血压并发抑郁症是临床上高血压患者常见的并发症之一，该病的发病率为26.8%，在中国人群中更为典型[31]，并且其发病率呈逐年上升的趋势。由于目前高血压并发抑郁症的具体发病机制尚不明确，大多数的治疗方案都是从抗抑郁和降血压以及改善临床症状入手，并没有从两者共性发病机制的关联入手，存在一定的局限性。西药治疗存在副作用大、易复发等缺点，中医药重视辨证论治和整体观，通过多靶点、多途径调节患者的临床症状。因此，将化学成分、药理作用、作用机制研究与临床需求相结合，开展中药复方更高层次的研究，对高血压并发抑郁症的防治具有重要的科学价值。

利用UPLC-Q-TOF-MS快速鉴定中药或复方中活性成分是当前的研究热点与趋势[32-35]。中药复方活性成分难于识别，常规方法提取活性成分费时费力，并且分离过程可能导致低含量活性成分丢失。中药复方化学成分的分析是中药发挥药效作用的物质基础，有助于进一步阐明中药复方的配伍规则和药理作用。

复方钩藤降压解郁方以复方钩藤降压片与天麻钩藤饮为基础方化裁而成；
方中钩藤、天麻为君药，滋阴潜阳，平肝息风；
地龙息风通络，为臣药，助君药化瘀息风之力；
佐以杜仲、桑寄生滋补肝肾，葛根解肌退热、生津止渴。以上药物作为基本方，再加入养阴柔肝、疏肝解郁的白芍、贯叶连翘等10味中药组成本方。

有文献表明[36]，天麻钩藤饮和其单味药材中主要包括黄酮类和生物碱类成分，但对于复方钩藤降压解郁方的药效物质基础尚未见相关报道。研究表明，天麻的主要有效成分是酚类及多糖类化合物，具有镇静催眠、抗焦虑、抗抑郁、神经保护、抗眩晕、调节循环系统、抗炎、镇痛、改善记忆等药理作用[37]。钩藤中的生物碱类主要化学成分具有抗氧化、抗炎和调节神经递质的作用，被广泛应用于治疗惊厥癫痫、高血压、抑郁症等疾病[38]。地龙中的活性蛋白具有防治高血压和动脉粥样硬化等药理作用[4]。白芍中的芍药苷、白芍苷等有效成分具有降低动脉硬化早期生物标志物的作用[39]。丹参主要包括黄酮类、萜类和酚酸类化合物，具有抗氧化、抗炎、降血糖和镇静等作用[40]。

本实验利用UPLC-Q-TOF-MS新技术从复方钩藤降压解郁方中快速鉴定化合物51个。鉴定出的化合物中来源于葛根18个、钩藤12个、丹参6个、川芎4个、白芍3个、地龙3个、天麻3个、杜仲1个、桑寄生1个、贯叶连翘1个。其中苯甲醛在天麻和贯叶连翘中均有存在。鉴定出的化合物中来源于葛根所含成分最多。葛根是临床常用中药材之一，为豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退热、升阳止泻的功效。葛根具有很好的降血压作用[41]，其主要有效成分是黄酮类化合物[42]，且主要的降血压活性成分是葛根素[43-45]。总离子流图显示葛根素在复方钩藤降压解郁方中含量最高。葛根素能扩张冠状动脉和脑血管，具有降低血压、改善神经纤维传导速度的功效[46-47]。GAO S等[48]研究表明葛根素可显著降低IL-1β、IL-6、IL-10等炎症细胞因子的表达，下调NF-κB的活性，从而抑制炎症反应，改善高血压并发抑郁症的症状。有文献报道，葛根素对重症高血压具有很好的心血管保护作用[49]。

本研究发现，高血压并发抑郁症模型组大鼠血压上升，且精神萎靡，食欲差；
同时其自主活动减少，摄食潜伏期延长，即其对未知环境的探索能力和兴趣明显下降；
糖水偏好程度降低，说明其快感缺失，无法从糖水奖励中体验到快乐；
海马组织中IL-1β、IL-6的含量升高，进一步验证了实验造模成功。复方钩藤降压解郁方组大鼠血压下降，自主活动增加，摄食潜伏期缩短，糖水偏好程度上升，海马炎症因子IL-1β、IL-6的含量明显降低，说明复方钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠有效，同时化学成分分析结果初步证明是其中含量最高的葛根素发挥了调节血压和缓解抑郁程度的作用，而且表明本方法可以在中药复方复杂体系中实现对活性成分的简单快捷高通量筛选。

本研究为复方钩藤降压解郁方的药效和物质基础提供了实验依据，也为后续学者开展高血压并发抑郁症相关研究提供了一些参考，但其单味药之间的协同作用及作用靶点尚需进一步研究。

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