毕节市刺梨多酚提取工艺优化及其含量分析
时间：2022-11-15 10:05:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
程杏安，刘 欣，张汉辉，东方云，王彩云，李恒谦，吕晓静，李俊杰，邹启文，蒋旭红*
(1.仲恺农业工程学院化学化工学院，广东广州 510225；
2.毕节市中药研究所，贵州毕节 551799)
刺梨(Tratt，RRT)，属于蔷薇科植物，是云贵高原等地区特有的一种植物资源。刺梨富含多种营养元素和功能成分，包括多糖、多酚、V、超氧化物歧化酶、黄酮、V及多种矿物质元素。有研究发现，刺梨中多酚类物质含量丰富，具有多元酚结构，主要由没食子酸、儿茶素、鞣花酸等成分复合而成，是极具开发利用价值的优质资源。此外，植物多酚的抗氧化能力被认为是抑菌及防治慢性疾病的基础。而提取工艺的不同会对多酚的组成和微观结构造成影响，因此选择合适的提取方法不仅是提高多酚提取率的关键，也是维持多酚的理化、流变性、功能、结构和生物学特性的关键。
多酚提取的方法有微波辅助法、有机溶剂浸提法、超声-微波协同辅助法和生物酶提取法等，其中有机溶剂浸提法主要是利用不同酚类成分在溶剂中溶解能力的差别，通过选用合适的溶剂采用浸提的方式使目标物质析出；
而生物酶可专一性地作用于植物胞壁与胞间的某些物质成分，导致细胞壁的紧密结构变得膨胀而疏松，细胞膜和细胞壁的通透性增强，进而使细胞内的目标成分更易浸出。笔者采用乙醇提取法和纤维素酶提取法，分别对刺梨果肉多酚进行提取，采用正交试验优化提取工艺条件，以DPPH和ABTS自由基清除率为指标，评价了2种提取方法的抗氧化活性，旨在为刺梨的开发利用及功能性研究提供理论依据。
刺梨样品为刺梨果期时，按规范采摘自贵州省毕节市7个县(区)的38个村庄(社区)。借助手机奥维地图选点定位各采样点，记录相关样品所在经纬度及海拔高度。共计56份样品，分为野生、贵农5号、贵农7号3个品种(表1)。
2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2，2’-azino-bis(3-ethyl benzothia- zoline-6-sulfonic acid)，ABTS]98%，上海麦克林生化科技有限公司；
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH]纯度≥98%，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；
福林酚，南京都莱生物技术有限公司；
纤维素酶，河南万邦实业有限公司。
UV-2450型紫外分光光度计，美国安捷伦科技有限公司；
L400台式低速自动平衡离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；
SCIENTZ-10N真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
表1 毕节市7个县(区)38个村庄刺梨产地的环境情况
没食子酸标准曲线的绘制。精确称取(0.100±0.001) g没食子酸，5 mL 70%甲醇溶解，用超纯水定容至100 mL配制没食子酸标准溶液(1 mg/mL)。分别移取 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL没食子酸标准溶液于100 mL容量瓶中，分别用超纯水定容至刻度，摇匀，得到的质量浓度分别为20、25、30、35、40、45 μg/mL。分别移取不同质量浓度的没食子酸工作液1 mL于10 mL 容量瓶中，加入5 mL 10%福林酚试剂，摇匀，反应3～8 min，加入4 mL 7.5%碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60 min。用10 mm比色皿，在765 nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。以没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，用origin 2021软件绘制没食子酸浓度-吸光度标准曲线图。
刺梨果肉多酚的提取工艺。
单酶提取法。产地赫章县威奢乡中银村的野生刺梨在同县区刺梨品种中多酚含量与出汁率均为最高，以其为试验样品，准确称取该刺梨果肉粉末放入烧杯，按试验设置的料液比在相应温度下恒温水浴，加入相应含量的纤维素酶于刺梨样品中提取一定时间，80 ℃下水浴灭酶2 min后，将提取液置于台式低速自动平衡离心机中3 000 r/min离心30 min，收集上清液，记录体积()，即得到刺梨果肉多酚提取液，测定多酚提取率。
乙醇提取法。准确称取赫章县威奢乡中银村的野生刺梨果肉粉末放入烧杯中，配置一定浓度乙醇水溶液待用，按试验设置的料液比将乙醇水溶液加入烧杯中，恒温水浴提取一定时间后置于台式低速自动平衡离心机中3 000 r/min离心30 min，收集上清液，记录体积()，即得到刺梨果肉多酚提取液，测定多酚提取率。
单因素试验及正交试验设计。
单酶提取法提取刺梨多酚。以料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度、纤维素酶含量为单因素，在单因素试验的基础上，选取提取时间、料液比、提取温度3个因素进行L(3)正交试验设计，确定最佳提取工艺。正交试验因素与水平见表2。
表2 单酶提取法正交试验设计
乙醇提取法提取刺梨多酚。以料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度、提取溶剂种类为单因素，同时在单因素试验的基础上，选取料液比、提取温度、提取时间3个因素进行L(3)正交试验设计，确定最佳提取工艺。正交试验因素与水平见表3。
表3 乙醇提取法正交试验设计
出汁率的测定。各组各取一部分刺梨，洗净后常温吹干，去除表面水分，而后进行刺梨重量计算，得到出汁前的重量()，将其放入榨汁机中榨汁，离心去除固体物质后，得到剩余溶液，称重得。
Folin-Ciocalteu分光光度测定法测定不同区域刺梨多酚含量。参考谭晓舒等的方法，分别取对照品没食子酸及待测多酚溶液，将待测多酚溶液稀释倍后，各取1.0 mL于10 mL离心管中，分别加入5.0 mL稀释10 倍的福林酚试剂(0.1 mol/L)，摇匀。反应3～8 min，加入4.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，充分混匀，黑暗处室温放置反应60 min。用紫外可见分光光度计在 765 nm 波长处测定吸光度值()，空白组以蒸馏水替代，每组平行测定3次。以为纵坐标()，没食子酸质量浓度为横坐标()，绘制标准曲线，得到没食子酸标准曲线方程=0011 4+0014 9(=0999 6)。根据没食子酸标准曲线计算待测溶液中的多酚含量，结果表示为没食子酸(gallic acid equivalents，GAE)当量浓度，即 μg/mL 。
式中，为待测溶液测得的吸光度；
为待测溶液稀释的倍数；
为提取离心后的待测溶液总体积，mL;为提取试验称取的刺梨样品质量，g。
抗氧化活性的测定。
清除DPPH自由基能力。参照陈永平等的方法，称取8 mg DPPH到小烧杯中，加无水乙醇溶解，将溶液转移到容量瓶中用无水乙醇定容至100 mL，即0.2 mmol/L DPPH溶液配制完成。用无水乙醇稀释多酚提取液至浓度分别为0.12、0.10、0.08、0.06、0.04 mg/mL。取2 mL稀释后的提取液和2 mL配制好的DPPH溶液到试管中。二者在室温黑暗处反应4 h，反应结束后在517 nm处测定，记作。样品对照组则以无水乙醇代替DPPH测定。空白组以无水乙醇替代样品液测定。用V重复步骤。所有试验均重复操作3次，取平均值。
以没食子酸浓度(μg/mL)为轴，以吸光度为轴，建立没食子酸标准曲线，得到回归方程=0011 4+0014 9，=0999 6，如图1所示其线性关系良好。
图1 没食子酸的标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid
单酶提取法。从图2可见，随着料液比增加，提取率先增后减，最大值为14.48%，这可能是由于继续增加料液比，纤维素酶的有效作用浓度被稀释，酶解不充分，最终多酚提取率下降。温度升高有利于加快分子间的运动，提高纤维素酶的活性，提取率最大值为14.48%，之后，由于多酚在较高温度下可能发生氧化或者降解，且纤维素酶可能因温度过高而失去活性，提取率下降。提取时间刚开始增加时，提取率不断增加，之后由于提取时间过长，多酚类物质发生了分解，使得提取率下降。乙醇浓度增大时，多酚提取率也随之增加，之后随着乙醇浓度继续升高，醇溶性和亲脂性强的杂质溶出增多，导致多酚类含量下降，提取率逐渐下降。提取率随纤维素酶含量的增加先升后降，在0.6%时达到最大值(14.90%)。这可能是由于细胞壁的分解，增大了细胞内液与外界的接触面积，促进酚类物质向溶剂中扩散，有利于多酚浸出。但随着纤维素酶含量的不断增加，酶与多酚形成络合物，使得多酚提取率下降。
图2 单酶提取法单因素对刺梨多酚提取率的影响Fig.2 Effects of single factors on polyphenols extraction rate of Rosa roxburghii Tratt by single enzyme extraction
乙醇提取法。从图3可见，提取率随料液比的增加先增后减，在1∶50时，达最大值17.0%。这可能是多酚的溶出已达到饱和，溶剂体积的进一步增加，反而促进了其他成分的溶出，当溶剂比例较低时，溶剂难以将多酚完全提取，增加溶剂用量，未溶解的多酚向提取剂中转移，溶剂与原料的比值越大，浓度梯度越大，有效成分的扩散速率也越大。由于温度升高有利于加快分子间的运动，溶剂与刺梨粉末接触也更加充分，因此促进了提取率的增加，到30 ℃时，提取率达到最大，为16.34%；
之后随着温度升高，多酚在较高温度下可能发生氧化或者降解，提取率开始下降。提取率随着提取时间的延长呈先增后减趋势，在40 min时达到最大值12.33%。之后由于提取时间过长，多酚类物质发生了分解，使得提取率开始下降。随着乙醇浓度增大，提取率不断升高，浓度为40%时，提取率最大，达11.85%。这是由于在乙醇浓度较低时，水溶性糖类等物质溶出，影响多酚的提取，随着乙醇浓度的增加，多酚与乙醇溶剂的极性越来越接近，根据相似相溶原理，多酚的提取量会增大，但乙醇溶液过高时，一些脂溶性成分也会浸出，同时乙醇与多酚类物质极性差异变大，乙醇溶液在高体积分数条件下会挥发出来，这些都会影响多酚的提取效果。脂溶性物质的极性与无水乙醇最为接近，因此，溶剂种类中，无水乙醇和60%乙醇溶液提取率均高于其他溶剂，参考乙醇浓度单因素结果可知，乙醇浓度超过40%时，提取率逐渐降低，可解释60%乙醇溶液的提取率高于无水乙醇的提取率。
图3 乙醇提取法单因素对刺梨多酚提取率的影响Fig.3 Effects of single factors on polyphenols extraction rate of Rosa roxburghii Tratt by ethanol extraction
单酶提取法。根据正交试验设计原理，进行L(3)正交试验设计(纤维素酶含量作误差列)，以确定刺梨多酚的最佳提取工艺，结果见表4。由表4可知，各因素对多酚提取率的影响表现为提取温度>料液比=提取时间，刺梨果肉多酚单酶提取法的最佳提取工艺组合为提取料液比1∶50，提取温度30 ℃，提取时间80 min。在该条件下重复3次试验得到提取率为14.27%。
表4 单酶提取法正交试验结果
乙醇提取法。在单因素试验结果的基础上，进行L(3)正交试验设计(乙醇浓度作误差列)，结果见表5。由表5可知，各因素对多酚提取率的影响表现为提取时间>提取温度>料液比，最佳提取工艺组合为料液比1∶60，提取温度40 ℃，提取时间50 min。该条件下重复3次试验得到的提取率为14.47%。
由表6可知，各地区刺梨多酚含量在9.57%～44.42%，最高为纳雍县水东镇锅嘎村，达44.42%，最低为金海湖新区小坝镇水井边村，仅9.57%。各地区的刺梨出汁率分布在35.30%～83.00%，最高为大方县黄泥塘镇甘塘村，达83.00%，最低为黔西县谷里镇新阳村，仅35.30%。刺梨鲜果榨汁后可作为原汁进行加工出售，提高经济效益，但刺梨成熟收获期为30 d左右，采摘后很快会变质腐烂，鲜果难以运输保存。因此，需在产地进行初加工，压榨成原汁后常温保存，不同地区刺梨出汁率的高低可作为筛选高品质刺梨的指标之一，作为其经济价值的参考。
表5 乙醇提取法正交试验结果
表6 毕节市不同地区刺梨多酚含量与出汁率
在相同的多酚浓度下，分别测定乙醇提取法和单酶提取法所得多酚的ABTS自由基清除能力，并与V进行对比，结果如图4a所示。在多酚浓度小于0.4 mg/mL，通过单酶提取法所得刺梨多酚的ABTS自由基清除能力强于乙醇提取法所得的多酚，2种方法均强于相同浓度下V的清除能力。由图4b可知，通过乙醇提取法所得刺梨多酚的DPPH自由基清除能力强于单酶提取法，强于相同浓度下V的DPPH自由基清除能力。由以上结果可知，通过不同提取方法得到的刺梨多酚均对DPPH和ABTS自由基具有较强的清除活性，可将其作为潜在的天然抗氧化剂进行开发利用。
该研究采用乙醇提取法和单酶提取法对刺梨果实中的多酚进行提取，并分别用正交试验对这2种刺梨多酚提取工艺进行优化，结果表明，单酶提取法的最优提取工艺为料液比1∶50，提取温度30 ℃，提取时间80 min；
乙醇提取法的最优提取工艺为料液比1∶60，提取温度40 ℃，提取时间50 min。此外，对比2种提取方法所得刺梨多酚的抗氧化性可知，在多酚浓度小于0.4 mg/mL时，单酶提取法所得刺梨多酚对ABTS自由基清除能力强于乙醇提取法所得多酚；
乙醇提取法所得多酚在浓度小于0.1 mg/mL时，清除率即可达到90%，且其对DPPH自由基清除能力强于单酶提取法所得多酚。据此可知，不同提取工艺可能会影响其抗氧化活性。
毕节市不同区域的刺梨多酚含量与出汁率结果显示，毕节市38个地区多酚含量在9.57%～44.42%，出汁率分布在35.30%～83.00%，不同地区与品种间的刺梨多酚含量与出汁率有差异。数据显示，贵农品种刺梨优于野生品种刺梨。根据毕节市不同地区采摘的刺梨多酚含量及出汁率的差异，可为后期大规模的种植、培育、加工刺梨提供科学依据。
图4 提取方法对刺梨多酚抗氧化活性的影响Fig.4 Effect of extraction method on antioxidant activity of Rosa roxburghii Tratt polyphenols
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