普通烟草茉莉酸生物合成途径3个基因的分子克隆、表征和表达分析

武兆云， 孙聚涛， 张智强， 薛 刚， 杨铁钊

(河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002)

茉莉酸主要包括茉莉酸甲酯(MeJA)及其前体茉莉酸(JA)。作为植物生长调节剂，茉莉酸在植物生长发育过程中起着明显作用，如种子萌发、花粉发育等，并能应对病原体感染、机械和害虫、非生物胁迫等。JA生物合成途径始于-亚麻酸，由质体内的13-脂肪氧化酶(LOX)催化，游离-亚麻酸转变成13-氢-过氧十八碳三烯酸[13-(OOH)-18 ∶3]。随后，丙二烯氧化合酶(AOS)将13-(OOH)-18 ∶3转化为高度不稳定的丙二烯氧化中间体，随后该中间体受到丙二烯氧化环化酶(AOC)的作用，产生12-氧代植物二烯酸(12-oxophytodienoic acid，12-OPDA)。OPDA随后从质体输送到过氧化物酶体中，在过氧化物酶体中，OPDA被OPDA还原酶3(OPR3)还原，然后经过3轮β-氧化，产生JA。

JA与植物非生物胁迫密切相关。在非生物胁迫中，干旱对农作物产量的制约最大。关于玉米的研究结果表明，在干旱胁迫下，4个转录本的表达量呈上调趋势，在伸长组织、成熟组织中的表达量最高。在干旱条件下，植物的整体LOX活性和丙二醛(MDA)含量与转录水平之间存在密切关系。因此可见，茉莉酸含量可能会随脂质氧化胁迫而增加，因为茉莉酸的生物合成包含氧化脂合成。缺氧对植物生长有严重的不利影响，并会造成严重的农业损失。最近的研究结果表明，外源茉莉酸甲酯可以增强野生型拟南芥对再氧化的耐受性，并且在JA生物合成过程中的突变体对再氧化表现出更高的敏感性。铝毒性是限制酸性土壤作物生产的另一个主要因素。根据JA生物合成或信号传导中突变缺陷的表型分析结果，JA在调节铝胁迫下的根生长抑制中发挥作用，外源施用JA增强了铝胁迫下的拟南芥根生长抑制。

作为植物生长和发育的关键大量营养元素，钾参与许多生理过程，包括酶激活、膜电势维持、电中和、气孔运动和渗透调节。迄今还没有文献阐明JA信号在植物缺钾中的作用，本研究旨在分析、和基因的分子特性和表达模式，了解其在烟草低钾胁迫下的调控作用，从而揭示JA合成途径参与烟草低钾胁迫的分子机制。

1.1 材料

1.1.1 植物材料和培养 将表面消毒的烟草种子(品种：ND202、NC89)播种在无菌培养皿中。NC89属于耐低钾品种，ND202属于低钾敏感品种。将烟草种子置于K充足(Hoagland配方，K浓度为 6 mmol/L)或低K(记为LK，K浓度为125 μmol/L)的培养基上。LK培养基由Hoagland培养基改良而成，添加1%(质量浓度)琼脂。

将幼苗置于相对湿度为70%的生长室中，在 28 ℃ 条件下光照培养16 h，然后在21 ℃条件下黑暗培养8 h。光照度约为100 μmol/(m·s)，7 d后收获新鲜的根，用于基因克隆。本试验于2021年3—8月在河南农业大学烟草学院育种试验室开展。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 使用()、()、()核苷酸序列作为查询序列，进行NCBI BLAST搜索(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，旨在识别烟草核苷酸收集NR/NT数据库中包含、和直向同源物的序列，从而搜寻出(X84040)、(AB778304)和(AJ308487)。

用3对引物进行PCR扩增：，上游引物5′-C G T T T T T C T T G G A A G G T T A T T G A G A G A G-3′，下游引物5′-A C A A T T T A G A A C T G G G C A C T T T G T G-3′；
，上游引物5′-A T G G C A G T A G C A A C A G C A A C-3′，下游引物5′-C T A A G C T C T C T T C A A A G A G G T T A T A G-3′；
，上游引物5′-C C A A C A C A T T T G C A A G T T C A T T C C-3′，下游引物5′-A G A G G A A A C G A T G A A C T T A C A T T G G-3′。

从普通烟草(L.)cDNA模板中扩增全长cDNA，使用扩增整个cDNA序列的引物，然后将、和的扩增片段克隆到pMD-19 Simple T载体(TaKaRa)中进行测序分析。

1.2.2 生物信息学分析 用ClustalW进行多序列比对分析，用MEGA 7构建、和进化树，设1 000次重复，使用默认参数。用ANTHERPROT进行氨基酸序列分析。用Interpro (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)扫描蛋白质序列以获取结构信息，用TargetP 1.1服务器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析预测包含N端前序的序列。用WoLF PSORT (https：//wolfpsort.hgc.jp/)确认3种酶可能的亚细胞定位。采用全自动蛋白质结构同源建模服务器 SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)进行NtLOX、NtAOS和NtAOC的三级结构预测。

1.2.3 过表达载体的构建 PCR生成的包含开放阅读框(ORF)的-片段、包含开放阅读框的Ⅰ-Ⅰ片段和包含NtAOC开放阅读框的Ⅰ-Ⅰ片段已被亚克隆到质粒 pCAMBIA1305.1-GUSPlus上。使用的引物如下：，上游引物5′-G G G G T A C C A T G T T T C T T G G A G A A G A T T G T G-3′，下游引物5′-G G G G T A C C C T A T A T G A C A C A C T G T T A G G-3′；
，上游引物 5′-A A C T G C A G A T G G C A G T A G C A A C A G C A A C-3′，下游引物 5′-A A C T G C A G C T A A G C T C T C T T C A A A G A G G T-3′；
，上游引物5′-G G G G T A C C A T G G C C A C T G C C T C C T C A G-3′，下游引物 5′-A A C T G C A G T C A A T T A G T G A A A T T T T T C A G G-3′。引物 M13-R 用于识别片段插入方向，基因融合表达由CaMV35S启动子控制。

1.2.4 表达分析 在处理3、4、5、6周后(weeks after treatment，WAT)收获幼苗。TRIzol® 试剂(Invitrogen公司，美国)用于从植物样品中提取RNA。用基因特异性引物对目的基因、、和(登录号：XM_016618658)进行qRT-PCR。在PCR中，使用 SYBR® Premix ExⅡ (TaKaRa Cat.RR820A)试剂盒配制反应溶液，使用StepOnePlus系统(应用生物系统)进行PCR，共设3次技术重复。将表达水平标准化为，然后使用 方法计算倍数变化。将以下基因特异性引物对用于qRT-PCR：，5′-T G C C C T C A G T T C T T G A T G G A G T-3′和5′-C T T T G C T G C G T T T C C C T T G T-3′；
，5′-G T T C G T C C C A T T A C A C T C T C-3′和5′-A G G A T C G G A A A A C T C T T G C C-3′；
，5′-C T C C A C C A A C T C C A A G T C A T-3′和5′-C C C C T T T C T T T T C C T C T T C G-3′；
和，5′-A A G G G A T G C G A G G A T G G A-3′和5′-C A A G G A A A T C A C C G C T T T G G-3′。

2.1 序列的克隆和生物信息学分析

在普通烟草中鉴定了JA合成途径中3个关键的基因，分别为、和。长2 831 bp，有1个可编码862个氨基酸的ORF，其相对分子量为97.6 ku。、的长度分别为1 569、983 bp(图1)。、分别编码522、245个氨基酸的ORF，相对分子量分别为58.9、26.5 ku。

NtLOX与来自普通烟草、番茄()、辣椒()和渐狭叶烟草()的脂肪氧化酶具有最大的相似度。烟草脂氧合酶与白黄麻()具有更高的同一性，NtLOX与CcLOX(登录号：OMO62561)的氨基酸序列同一性为73%。

NtAOS与来自普通烟草、马铃薯()、辣椒和渐狭叶烟草的丙二烯氧化合酶具有最高的相似度。NtAOS与甜瓜具有较高的氨基酸序列同一性，NtAOS与CmAOS1(登录号：NP_001315375)之间有68%的氨基酸序列同一性。

NtAOC与来自普通烟草、马铃薯、番茄、莨菪()和长春花()的脂肪氧化酶具有最大的相似性。烟草AOC与蒺藜苜蓿()的同一性更高，NtAOC与MtAOC(登录号CAI29046)的氨基酸序列同一性为65%。

图2-A显示了NtLOX与其他植物物种特征蛋白之间的关系，其中NtLOX与NbLOX之间的关系最密切。图2-B显示了NtAOS与其他植物物种特征蛋白之间的关系，其中NtAOS与NaAOS之间的关系最密切。图2-C显示了NtAOC与其他植物物种的特征蛋白之间的关系，其中NtAOC与StAOC、SlAOC、HnAOC、LcAOC之间的关系最密切。

2.2 NtLOX、NtAOS和NtAOC的结构分析

Interpro序列分析和分类结果显示，NtLOX属于植物脂肪氧化酶家族(结构域编号：IPR001246)。NtLOX包含3个域：PLAT/LH2域(结构域编号：IPR001024，17～173位氨基酸)、结构域3(结构域编号：IPR027433，289～378位氨基酸)和C端(结构域编号：IPR013819，163～862位氨基酸)(图3-A)。此外，在NtLOX的518～532位氨基酸处发现了1个铁结合位点。GO途径和分子功能预测结果表明，NtLOX参与氧化还原过程(GO：0055114、0016702)。NtAOS是细胞色素P450、E类、Ⅳ组(结构域编号：IPR002403)家族成员(图3-B)。结构域分析结果表明，NtAOS的57～506位氨基酸将其归类为SSF48264超家族的一部分。与NtLOX类似的是，NtAOS参与氧化还原过程(GO：0055114、0016705)。结构域分析结果显示，NtAOC的73～245位氨基酸可能编码属于SSF141493超家族的域。分子功能分析结果表明，NtAOC具有异构酶活性(GO：0016853，图3-C)。

蛋白激酶C、酪氨酸激酶和酪蛋白激酶Ⅱ诱导的磷酸化以及-肉豆蔻酰化位点在NtLOX、NtAOS和NtAOC中高度保守。除了所有3种蛋白质共有的位点外，笔者还在NtLOX中发现了另外2个位点，即-糖基化位点、依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点。

使用TargetP 1.1服务器分析NtLOX的亚细胞定位，分别获得了概率值为 0.134、0.093和0.040的叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)和信号肽(SP)。NtAOS的TargetP 1.1分析得出的cTP、mTP、SP概率值分别为0.802、0.148、0.127，表明NtAOS最有可能位于叶绿体上。NtAOC的TargetP 1.1分析得出的cTP、mTP、SP概率值分别为0.954、0.044、0.005，表明NtAOC位于叶绿体中。WoLF PSORT被用于进一步预测蛋白质的亚细胞定位。结果显示，NtAOS、NtAOC明确定位于叶绿体上，而NtLOX定位于细胞质上。不同LOX蛋白在不同细胞器中发挥着不同的作用，拟南芥基因组至少包含4个基因，其中位于细胞质中，位于质体基质中。与类似的是，、包含叶绿体转运肽序列，但它们被视为质体。在叶片衰老的过程中，的表达量明显升高，而的表达量急剧下降。

NtLOX的SWISS-MODEL预测结果表明，该蛋白质与大豆脂氧合酶(LOX-3) 1rrl.1相似，在氨基酸模型-模板范围内具有65.33%的序列同一性(25～862位氨基酸，图4-A)。NtAOS的全自动蛋白质结构同源性建模结果表明，该蛋白质与拟南芥AOS 3dsi.1具有结构相似性，在氨基酸模型-模板范围内(57～522位氨基酸)中具有68.63%的序列同一性(图4-B)。NtAOC的蛋白质结构同源性建模结果表明，它在结构上与拟南芥AOC2 4cq6.1相似，在氨基酸模型-模板范围内(73～245位氨基酸)具有67.43%的序列同一性(图4-C)。

2.3 过表达载体的构建

将限制酶消化位点引入开放阅读框中，Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅰ位点分别被引入、和。每个基因序列通过PCR扩增(图5-A)，每个片段用相应的限制酶消化(图5-B)。将限制性片段亚克隆到质粒pCAMBIA1305.1-GUSPlus中。用扩增基因序列的引物鉴定成功转化的含有所需质粒的菌落(图5-C)。其中引物M13-R用于确定、的插入方向。存在扩增片段表明插入片段处于正向(对应图5-D，对应图5-E)。

2.4 NtLOX、NtAOS和NtAOC的表达分析

在钾充足的条件下，烟草ND202的基因型比NC89的基因型积累了更多的钾。然而，ND202比NC89对低钾胁迫更敏感。有趣的是，在ND202、NC89植物中，、在钾充足条件下的表达水平高于低钾条件(ND202对应图6-A、图6-C；
NC89对应图6-B、图6-D)。在钾充足条件下，NC89的相对表达水平在4、5、6 WAT时分别是0.76、2.55、1.83倍(图6-B、图6-D)。在缺钾条件下，ND202的、表达水平在4、5、6 WAT没有明显变化(图6-C)。然而，在相同条件下，在5 WAT转录水平下表达水平明显增加(图6-C)，NC89在4 WAT的相对表达水平明显改变并持续到6 WAT。值得注意的是，NC89的相对表达水平在4、5、6 WAT时分别是3.24、2.38、5.41倍(图6-D)。上述结果表明，无论植物的基因型如何，在钾充足的条件下，、的表达量都会增加(图6-A、图6-B)。在缺钾条件下，与ND202敏感基因型相比，NC89耐受基因型的表达更为及时，并持续更长时间。因此可见，的表达水平可能与植物对低钾胁迫的抗性相关。

有文献报道了拟南芥铝胁迫3 h时，与根中JA合成相关的基因上调表达，如、和。当铝胁迫持续6 h时，、和的表达水平下降。然而，铝胁迫对与JA生物合成相关的其他基因的表达没有影响，如、和。据报道，缺钾植物中JAs、羟基-12-氧代-十八碳二烯酸和12-氧代-植物二烯酸的水平高于钾充足的植物。在低钾胁迫下，13-LOX途径中的营养储存蛋白(vegetative storage protein，)、和其他酶的转录水平增加。与对照相比，在N、P或Ca缺乏条件下生长2周的植物中，或的转录水平没有增加。然而，在缺钾植物中，、转录本大大增加，分别编码9-LOX和另一种 13-LOX，同种型的、没有太大变化。本研究结果也表明，并非所有JA合成相关基因都对低钾胁迫能作出反应(图 6-C、图6-D)。

越来越多的研究发现，JA在非生物胁迫中具有重要作用。淹水会导致植物缺氧，淹水后暴露于氧气(即再充氧)中称为复氧。参与茉莉酸合成途径的基因(包括、和)的转录水平在复氧过程中上调。外源性MeJA的应用提高了拟南芥对复氧胁迫的耐受性，而缺乏JA 合成(如和)和信号通路(如和)的突变体对复氧的敏感性增加。编码JA信号传导所必需的关键转录因子。与野生型相比，MYC2-OE显示出较少的损伤，而、突变体在再充氧4 d后显示出更多的损伤。这些发现表明，JA通过激活抗氧化防御系统，成为植物对淹没后复氧反应必不可少的主要上游信号分子，这反过来又有助于减轻复氧引起的氧化损伤，进而提高植物对复氧胁迫的耐受性。

干旱是作物生产力的主要限制因素。近期的研究发现，JA途径参与了玉米的干旱胁迫。关于玉米微阵列的研究发现，在干旱胁迫下，编码LOX同种型的6种LOX酶中的4种酶的基因(即、、和)的表达水平提高，在伸长、成熟组织中、的表达水平最高。总LOX活性和MDA含量紧随响应干旱的转录谱，向叶的成熟部分增加，表明干旱在叶片的所有区域诱导氧化损伤，成熟组织表现出最强的反应。这些结果表明干旱胁迫会对叶片所有部分造成氧化损伤，在成熟组织中观察到最强的反应。有研究者观察到随着叶片的成熟脂质过氧化，部分LOX活性增强。这些结果可以支持茉莉酸的产生是因为茉莉酸生物合成涉及通过脂质氧化合成脂氧合物(oxylipins)，特别是，其转录水平在胁迫条件下被显著诱导，这是造成根中胁迫诱导茉莉酸积累的原因。

凭借与生长素、乙烯的相互作用，茉莉酸对调节环境胁迫下的根系生长发育极为有益。例如，由于盐分胁迫，水稻生长普遍受到限制。突变体对盐胁迫表现出较弱的敏感性。和突变体可以在其叶片中积累少量Na，并且可以更好地清除盐胁迫所产生的活性氧。在应激传导中，野生型叶片及JA突变体可以积累相似数量的脱落酸。在宽型叶片中，JA及其氨基酸结合物(JA-异亮氨酸)的水平变化不大。相比之下，野生型强烈诱导JA前体12-OPDA对盐胁迫作出反应，这在突变体中没有出现。突变体中12-OPDA的缺失不仅与普遍增加的活性氧清除活性相关，而且与抗氧化途径中特定酶的更高活性相关。外源JA加强了对铝诱导的根生长的抑制。此外，根据JA生物合成或信号传导缺陷突变体的表型分析结果，JA参与调节了铝诱导的根生长抑制。总之，JA对于植物生长的调节是复杂的。

JA对非生物胁迫具有重要意义。本试验基于qRT-PCR分析了在缺钾条件下2种基因型品种JA合成途径3个基因的表达模式，耐低钾基因型表达水平升高更早且持续时间更长，表明的表达水平可能与低钾胁迫的耐性相关。

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