新生儿线粒体12S,rRNA基因筛查对预防药物性耳聋的价值
时间：2022-11-05 12:15:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
孙东兰，王少雄，张 晶，彭园园，乔彦霞，胡亚芳，张 静
线粒体12S核糖体核糖核酸(ribosomal rbonucleic acid，rRNA)基因位于人类线粒体DNA编码区，是线粒体核糖体的重要组件，负责完成线粒体内的翻译，参与线粒体相关蛋白质的合成。线粒体12S rRNA基因是药物性耳聋相关的突变热点区域，携带此基因突变的个体对氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides antibiotic，AmAn)高度敏感，接触AmAn可导致不可逆的听力损伤。因此，对新生儿进行线粒体DNA(mtDNA)12S rRNA的A1555G、C1494T药物敏感突变位点筛查，对安全用药具有重要的指导意义。本研究应用荧光定量PCR技术对新生儿进行上述基因突变位点筛查，依据结果给予用药指导和后代遗传性耳聋发病的风险评估，并对阳性个体进行疫苗预防接种随访分析。
1.1 对象 2018-12至2021-10在石家庄市第四医院出生的46 376例新生儿为研究对象，男女比例1.12∶1。全部新生儿均于出生后2～3 d通过TEOAE和AABR进行了听力筛查，参与药物性聋基因检测者由其监护人签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 试剂与仪器 药物性聋基因检测试剂盒(荧光PCR法)(英盛，济南)，ABI 7500扩增仪(Thermo Fisher，美国)，ND 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher，美国)。
1.2.2 样本采集和DNA提取 新生儿出生后采集脐带血滴血片，或在生后2～3 d采取足跟末梢血3～4滴，自然晾干后从血斑提取基因组DNA，取2 μl用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。
1.2.3 荧光定量PCR PCR反应液完全解冻后放置室温30 min，充分混匀并短暂离心。每个PCR反应管分装23 μl待测位点的PCR反应液，加入2 μl待检DNA后上ABI 7500扩增仪扩增。扩增程序按试剂盒说明书进行。
1.2.4 结果判定 FAM曲线成S形，且Ct值小于35，HEX(VIC)曲线无扩增或Ct值大于37，结果为野生型。HEX(VIC)曲线成S形，且Ct值小于35，FAM曲线无扩增或Ct值大于37，结果为均质突变型。FAM曲线成S形，且Ct值小于35，HEX(VIC)曲线成S形，且Ct值小于35，结果为异质突变型。
1.2.5 随访 对携带12S rRNA A1555G或C1494T突变的个体(年龄：5～32月龄)进行电话随访，主要内容包括家族史，药物应用史，孩子是否常规预防接种疫苗，听力情况，言语发育等。并对同期生育的婴幼儿(携带者2倍)进行是否常规预防接种疫苗的随访。
1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0进行统计分析。采用检验的方法比较携带突变婴幼儿组与未携带组疫苗接种率的情况，以<0.05为有统计学意义。
2.1 新生儿听力筛查结果 46 376例新生儿均通过了TEOAE和AABR的听力筛查，未检出听力异常新生儿。
2.2 药物性聋基因筛查结果
2.2.1 基因突变数据分析 线粒体12S rRNA基因检测结果中共发现突变94例，突变携带率为0.20%。其中12S rRNA A1555G均质突变76例(80.85%)，40例男婴，36例女婴；
异质突变14例(14.89%)，12例男婴，2例女婴。C1494T均质突变3例(3.19%)，1例男婴，2例女婴；
异质突变1例(1.06%)男婴。
2.2.2 突变个体家系随访分析 94例家系成员无耳聋家族史，无药物致聋史，携带者母亲孕期无有毒有害物质接触史。经随访72例A1555G 均质突变(其他4例拒绝)新生儿的母亲知情同意后接受了该项检测进行验证，72例均遗传于母亲。11例12S rRNA A1555G异质突变(其他3例拒绝)，1例C1494T异质突变新生儿的母亲知情同意后接受了该项检测，其中10例A1555G异质突变和1例C1494T异质突变遗传于母亲。1例男婴12S rRNA A1555G 异质突变为新发，其母亲12S rRNA A1555G为野生型，经耳聋基因芯片及测序均证实。
2.3 疫苗接种病例对照随访分析 携带突变婴幼儿随访到88例，失访6例，随访年龄5～32月龄，88例婴幼儿家长均知晓禁用氨基糖苷类抗生素，78例按月龄常规预防接种疫苗，10例接种部分疫苗(2例幼儿家长担心致聋未接种，8例幼儿判定为接种禁忌证)，正常接种率88.64%。随访同期生育的未携带突变的婴幼儿160例，160例婴幼儿基本按常规接种时间接种疫苗(部分婴幼儿因感冒发烧的推迟接种)。携带突变个体正常疫苗接种率与未携带者之间存在统计学差异(=16.123，<0.01)。所有随访到的婴幼儿听力未见异常，言语发育在同龄水平。
3.1 常规筛查的意义 常规的新生儿听力筛查可以检出部分听力障碍患儿，但尚有部分迟发型聋患者可以通过听力筛查，当遇到某些诱发因素时导致听力受损，比如药物性聋患者，出生时大部分听力无异常，只是在生长过程中由于使用氨基糖苷类抗生素导致听力障碍。因此，为了更加完善听力筛查工作，早发现，早预防，除了进行常规物理筛查外，联合耳聋基因筛查十分必要。研究显示联合筛查可降低听力障碍漏诊率，尤其是提高药物性、迟发型聋的检出率。
mtDNA是人体细胞内唯一的核外遗传物质，是细胞能量代谢的来源，亦是氧化磷酸化的中心，对保持细胞正常功能起重要作用。在遗传性非综合征性聋中，线粒体遗传约占2%，其中12S rRNA上的C1494T和A1555G和药物性聋密切相关。Prezant等在1例阿拉伯-以色列非综合征型聋家系中研究指出：1555位于高度保守的小rRNA结构域，这个结构域被2个保守的茎环切割，当发生A1555G突变时会破坏小rRNA结构，影响线粒体核糖体的翻译能力，ATP产量下降，细胞内外离子浓度失衡，最终导致线粒体功能障碍。在耳蜗的外毛细胞、支持细胞和血管纹中含有大量的线粒体。在耳蜗底转的外毛细胞含量更多，所以线粒体的功能异常更易影响高频听力。
线粒体DNA 12S rRNA A1555G和C1494T位点(分别对应E.coli 16S rRNA的1491位点和1409位点)位置相对但并不配对。当发生A1555G突变或C1494T 突变时， 线粒体核糖体A位形成了一个新的1494-1555G-C或 A-U碱基配对， 使得线粒体12S rRNA基因与E.coli 16S rRNA相应解码区更加相似， 增强了氨基糖苷类药物在12S rRNA A位的结合力。因此，使用氨基糖苷类药物会导致或加重携带A1555G 或 C1494T突变个体的听力丧失。美国的研究显示12S rRNA基因 A1555G 突变可以增加耳蜗对氨基糖苷类药物的敏感性。西班牙的非综合征型家系调查研究显示A1555G 突变与15%～20%的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖苷类药物也可发生听力下降。在中国群体的研究发现12S rRNA A1555G和C1494T 突变与药物性聋有关。
药物性聋患者基本都能通过听力筛查，如果个体携带与细菌的核糖体更加相似的1555G 或 1494T突变，则对氨基糖苷类药物超敏感，当使用氨基糖苷类药物时导致聋。而且线粒体DNA 12S rRNA突变为母系遗传，女性的子代均为突变基因携带者，男性个体为携带者但不会遗传给下一代。本研究对46376例在本院分娩的新生儿进行药物性聋基因筛查发现A1555G和C1494T突变率为0.20%，虽然低于山西长治(0.35%)，北京市(0.27%)，浙江省长兴县(0.28%)，广东东莞地区(0.22%)等地的药物致聋基因突变率，但高于邯郸(0.15%)，绍兴(0.12%)及广东省江阳市(0.11%)等地区。郑锦等发现，河南洛阳地区线粒体DNA 12S rRNA基因变异的阳性携带率为0.23%，最常见变异类型为A1555G异质性变异；
本研究结果显示最常见的变异是A1555G 均质突变，占80.85%，这也提示突变率和变异类型均可能存在地域差异性。
本研究还发现10例12S rRNA A1555G异质突变(其他3例拒绝)，1例C1494T异质突变均遗传于母亲。发现1例新发12S rRNA A1555G异质突变，其母亲在孕期聋基因筛查显示12S rRNA A1555G为野生型，胎儿出生后做药物性聋基因检测为12S rRNA A1555G异质突变，并通过聋基因芯片及Sanger测序检测验证。首先，目前关于导致12S rRNA A1555G突变的分子机制尚不明确，因此尚需通过动物实验、线粒体的功能实验等研究进一步探索引起12S rRNA A1555G新发突变的影响因素及相关机制；
其次，目前关于12S rRNA A1555G新发突变的发生率尚无确切数据，尚需通过临床研究进行统计分析；
再次，12S rRNA A1555G突变在代代传递时是否存在异质率增加的情况，比如本例胎儿的母亲可能也存在12S rRNA A1555G异质突变，但异质率尚未达到现有检测的下限。最后，是否存在生殖腺嵌合？我们将带着这些疑问开展后期的研究探索。
3.2 随访携带突变的阳性个体的疫苗接种情况 本研究还对88例阳性个体(6例失访)进行电话随访，随访年龄为5～32月龄。88例婴幼儿家长均已接受用药指导，78例(88.64%)婴幼儿已常规预防接种疫苗，10例(11.36%)只接种了部分疫苗。随访同期生育的未携带突变的婴幼儿160例，均接种疫苗。文献[20]报道携带A1555G等突变的具有遗传易感性的患者即使用常规剂量或极小剂量的AmAn即可发生耳毒性反应，可能造成极重度且不可逆转聋；
对于儿童而言， 即使轻度听力损失也会对其言语发育及心理社会发育产生不良影响。给药途径及局部给药部位对AmAn耳毒性作用亦有影响，椎管内给药最危险，其次为静脉和肌内注射。邓水秋等发现，对于适龄的线粒体A1555G基因突变携带女童，最好禁止使用含氨基糖苷类抗生素的疫苗。部分父母担心孩子注射含有氨基糖苷类抗生素的疫苗会影响孩子听力，在尚无公开的的指导意见或专家共识的前提下，选择放弃接种疫苗。文献[23]对以往研究进行综述，尚不能推断疫苗中痕量的抗生素会导致聋。AEFIIMS数据亦未呈现出线粒体12S rRNA位点突变儿童接种疫苗后引起儿童聋的报道。肾脏是氨基糖苷类抗生素排泄的唯一途径，对于肾脏功能正常的人群，耳毒性抗生素以正常的排泄速率被排出到体外。疫苗中氨基糖苷类抗生素的最大残留量很低，远远低于临床常规剂量，在婴幼儿肾功能正常的前提下，接种疫苗应该是相对安全的。本研究随访结果也提示，接种疫苗是相对安全的，若能开展痕量AmAn耳毒性的研究，明确其耳毒性阈值，将有利于指导疫苗中抗生素的残留量，进一步提高接种疫苗的安全性。
本研究发现，通过线粒体聋基因筛查，可从分子水平发现有可能发生听力损伤的新生儿，对药物性聋高危患儿的终生用药提供指导，避免迟发聋的发生，具有重要的社会效益，同时也进一步证实了该疫苗的安全性，为相关指南的出台提供临床依据。
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