杠柳苷元抑制人乳腺癌细胞增殖作用的研究|杠柳毒苷

时间：2019-04-20 03:25:59　来源：柠檬阅读网本文已影响人

　　【摘要】目的观察杠柳苷元(periplogenin)对人乳腺癌细胞MCF7的抑制作用并考察其抑制作用的机理。方法使用四氮唑盐(MTT)法测定杠柳苷元对MCF7细胞的增殖抑制效果，并使用蛋白免疫印迹法测定其中凋亡蛋白的表达。结果杠柳苷元对MCF7细胞起到了明显的抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性，蛋白免疫印迹法也观察到杠柳苷元促进MCF7细胞内凋亡相关蛋白的表达，其表达呈时间依赖性。结论杠柳苷元具有显著的体外抑制MCF7细胞增殖的作用，其抑制作用是通过促进MCF7细胞凋亡而发挥的。
　　【关键词】杠柳苷元；乳腺癌；凋亡
　　作者单位：453003 新乡市第二人民医院药剂科(李海霞)；新乡医学院三全学院教务部(韩琛李一光) 杠柳是主产于中国辽宁、吉林、河北、山东、山西等省区的一种萝藦科植物［1］，其干燥的根皮即称为“香加皮”，含有甾醇、酯类等多种化合物［2］，具有祛风湿、强筋骨、利尿、驱虫、升压等多种药理功效［3］。
　　近年来，随着中药有效成分研究的进展，对于传统中药香加皮研究发现了多种不同于传统应用的药理学作用，例如抗炎作用［4］、强心作用［5］、抗癌作用［6］等，而其中杠柳苷元是香加皮产生抗炎作用的物质基础［4］，并在香加皮抗肿瘤的过程中发挥了重要作用。为观察杠柳苷元的体外抗乳腺癌细胞的作用，对其机制做较为深入的探讨，特开展本实验，为客观评价和进一步开发研究其临床应用价值提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与试剂杠柳苷元由中药香加皮提取纯化而得到，纯度大于98%；MCF7由沈阳药科大学中日医药研究所惠赠；DMEM培养液购自Hyclone公司(UT，USA)；胎牛血清购自TBD公司(天津，中国)，proCaspase9、Caspase9、Caspase3抗体及辣根过氧化酶标记的二抗购自Santa Cruz公司(CA，USA)，MTT购自Sigma公司(MO，USA)。其他试剂均为分析纯。使用的仪器为二氧化碳培养箱(NuAir，USA)，DYYIII28A型蛋白电泳仪(北京，中国)，酶联免疫分析仪(Tecan，Austria)。
　　1.2 实验方法 ①MTT法:取处于对数生长期的MCF7细胞，以1×105cell/ml的密度接种于96孔板中，每孔100 μl，培养18 h后，加入含有杠柳苷元(0160 μm)的培养液，于37℃，5%CO2条件下继续培养18 h，在显微镜下观察细胞形态学的变化后，每孔加入MTT 15 μl(5 g/L)，DMSO150 μl溶解后，于酶标仪492 nm处检测，测定吸光值，并计算抑制率，绘制各点的抑制率反应曲线。
　　抑制率(%)=［A492(control)A492(periplogenin)］/［A492(control)A492(blank)］×100%。②蛋白免疫印迹法:将MCF7细胞以5×105cell/ml的密度接种于培养瓶中，每瓶8 ml，培养18 h后，加入浓度为0和75 μm的杠柳苷元，作用6、12、18 h后，用0.05%的胰酶将MCF7细胞消化下来，终止消化并将细胞混悬液离心。加入细胞裂解液冰浴裂解30 min，12000r/min离心10 min后提取上清，测定蛋白浓度，以10% SDSPAGE电泳分离蛋白，并将蛋白过夜转移到硝酸纤维素膜上，封闭后加入小鼠抗人Caspase3、兔抗人Caspase9以及兔抗人proCaspase9孵育过夜，漂洗后加羊抗鼠或羊抗兔的二抗结合，漂洗后用TTBS洗膜，加入ECL显影剂显色后用胶片曝光，定影后得到上述蛋白的条带。
　　2 结果
　　2.1 杠柳苷元对MCF7细胞生长和增殖的抑制作用。
　　如图1所示，杠柳苷元以40 μm及以上的浓度作用于MCF7细胞18 h时，均具有明显地抑制作用(P 　　
　　参考文献
　　［1］中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志. 北京: 科学出版社, 1977: 273274.
　　［2］张援虎,王锋鹏. 杠柳属植物化学成分研究进展. 天然产物研究与开发, 2003,15(2): 157161.
　　［3］国家药典委员会. 中国药典一部. 北京：化学工业出版社, 2005:181.
　　［4］ YiNa Zhu, WeiMin Zhao, YiFu Yang, et al. Periplocoside E, an Effective Compound from Periploca sepium Bge, Inhibited T Cell Activation in Vitro and in Vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2006, 316 (2): 662669.
　　［5］李玉红, 高秀梅, 张伯礼, 等. 香加皮提取物对离体心脏功能的影响.辽宁中医学院学报, 2005, 7(4):396397.
　　［6］陈书红, 杨峻山, 任风芝, 等. 香加皮的抗肿瘤活性成分研究. 中草药, 2006, 37(4): 519520.
　　［7］ Park JA, Kin KW, Kin SI, et al. Caspase3 specifically cleaves p21WAF1 /C IP1 in the earlier stage of apoptosis in SKHEP1 human hepatoma cells. Eur J Biochem,1998; 257(1): 242248.
　　［8］ Kim HE, Oh JH, Lee SK, et al. Ginsenoside Rh2 induces apoptotic cell death in rat C6 gliomal via a reactive oxygen and caspasedependent but BclX(L)independent pathway. Life Sci,1999, 65(3): 3340.
　　［9］ RuizVela A, Korsmeyer SJ. Proapoptotic histone H1.2 induces CASP3 and 7 activation by forming a protein complex with CYT c, APAF1 and CASP9.FEBS Lett, 2007, 581:3422.
　　［10］ Hideji Hokawa. Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fraction from Periploea Sepium. Chem Pharm Bull, 1988, 36(3):982988.

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