水通道蛋白在哪_水通道蛋白的研究
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【中图分类号】Q503;
D919.1
【文献标识码】B
【文章编号】1007 9297(2004)01—0053—03
一
、水通道蛋白的发现
水是生物机体细胞的主要成分,每时每刻有大量的水分子
通过细胞膜进出细胞。在90年代以前,对于水分子的转运机
制,主要有两种理论解释,一种是水分子的简单扩散学说,认为
细胞内外渗透压差是其动力源,需要较高的阿里纽斯活动能
(Arrhenius activation energy,以下简称Ea),一般Ea> 10 keal/
mol,达到平衡时渗透率(Coefficient of osmotic permeability,简称
Pf)与扩散率(Coefficient of diffusional permeability,简称Pd)趋于
相等,不能被汞等通道蛋白阻断剂所抑制。但水分子简单扩散
理论不能解释一些生理现象,如尿的浓缩、Pf/Pd> 1时水的转
· 法医学理论与实践·
运及有些细胞水转运可被通道蛋白阻断剂抑制等,所以就产生
了另一种理论,认为细胞膜上存在水分子转运的特殊通道,即水
通道学说。水分子通过该通道进出细胞,水通过水通道时需要
的Ea较低,一般Ea<5 kcal/mol。但限于当时的技术条件,一直
未能证实水通道的存在。_1 J1988年Agre等 在纯化人的红细
胞膜上Rh蛋白时,偶然发现了一种新的膜蛋白,分子量约28 kD
左右,属于一种内在膜整合蛋白(Channel forming integral mem—
brane protein,简称CHIP28)。1991年CHIP28的cDNA 分子克
隆成功,并成功地将CHIP28体外转录合成的cDNA转染非洲
爪蟾的卵母细胞,结果发现转染后的卵母细胞在低渗透溶液中
很快膨胀,并最终破裂。[ , 又将CHIP28嵌入脂质体进行实验,
能明显加快水的转运_8],从而证实CHIP28对水有特殊通透性:
1993年Arge将这种内在膜整合蛋白正式称为水通道蛋白
(Aquaporins,简称AQPs)。[ ]目前已发现9种水通道蛋白亚型,
· 54 ·
按顺序分别命名为AQPa~AQP9,它们形成一个AQPs家族,考
虑到以前发现的一种膜内在蛋白,又称MIP(major intrinsic protein,
简称MIP),也对水有一定的通过作用,有些学者把它也归
入水通道蛋白家族中,取名为AQPo:
二、AQPs的结构
AQPs为细胞膜上的一种糖蛋白,分子量为30 kD 左右。
AQPs家族的结构主要是通过对AQPa的疏水性分析研究推测
出来的,AQPa的蛋白结构研究得最清楚,它的一级结构为含6
个螺旋的单肽链,连续跨膜6次,含3个胞外环(A、c、E)和2个
胞内环(B、D),B环和E环具有疏水性,B环位于细胞内侧,E环
位于细胞外侧,其余3个环为亲水性,它们均存在细胞膜脂质层
中,其氨基端(NH2一)和羧基端(COOH一)位于细胞内,整个
AQP分子前后两部分在序列上相似,呈对称的镜像结构,并且B
环和E环均具有天冬酰氨酸一哺氨酸 丙氨酸基本单元
(APA),APA为AQP家族的共有特征结构,对水的通透性具有
决定性作用。l6 通过对整合有CHIP28分子的脂质体进行标记重
组、冰冻蚀刻及形态学测量等方法研究,证实AQPs蛋白在细胞
膜上以四聚体形式存在,每个单体单独形成一个水通道,B环和
E环各形成半个水通道,它们在细胞膜脂质分子层中相互重叠形
成一个完整的水通道。L1 n J
有些水通道对含汞试剂敏感,其功能可被汞试剂抑制。这
是因为这些水通道蛋白的NPA前序列中存在189一半胱氨酸残
基,该残基为汞的特异性结合位点,一旦汞试剂与这个位点结
合,就可抑制水通道。在现在已知的AQPs家族中,只有A0P4
和AOP7的NPA前序列不含189一半胱氨酸残基,它们为汞不
敏感性水通道蛋白。_7·lo 3
三、AQPs的功能与调节
AQPs对水有选择性性通透作用,将体外转录合成的水通道
cDNA注入非洲爪蟾的卵母细胞和嵌入脂质体进行实验,证明水
的渗透率(Pf)呈数十倍地增加,C 6-8]从而证实AQPs对水有特殊
通过性。AQPs对各种离子不具有通过性,_1 3_它们的功能不受
温度、质膜成分的影响,但有的研究证实AQP3和AQP7对甘油
和尿素等有机小分子有一定的通过性,并且它们的核苷酸序列
也很相似,[14, ]可据此将AQPs家族分为两个亚家族,即AQP3
和AQP7为一个亚家族,其余AQPs为另一个亚家族。
对AQPs的调节存在长期和短时调节之分。长期调节作用
在核酸转录水平上,主要表现为AQPs的mRNA合成增加,蛋白
表达量增强,如皮质醇类激素可以从该水平上增加AQP1的表达
等。[ ]短时调节主要表现为细胞浆内的囊泡等膜单位短时与细
胞膜融合,它们膜上的AQPs转移到细胞膜上,导致细胞膜单位
面积上AQPs的量短时增加,如当受到加压素的作用时,肾组织
细胞浆中的囊泡与肾脏细胞顶端膜融合,使囊泡中的AQP2转移
到胞膜中发挥作用,一旦刺激消失,又通过形成囊泡载体,AQP2
返回到胞浆中,从而减少细胞膜上的AQP2,水通透性降低,所以
这种短时调节机制又称为“穿梭机制”。
l
四、AQPs的组织分布
水通道蛋白在人类妊娠早期就开始表达,胎儿12周龄时就
可以检测到,36周龄时AQPs表达明显增加,出生时其红细胞和
肾小管中的AQPs表达量就几乎与成人相等,而在小鼠的表达需
出生后1~2个月才趋于高峰并持续。ll
AQPs在大鼠中的分布研究得比较多,也比较清楚,在人体
法律与医学杂志2004年第11卷(第1期)
组织中的研究比较少,但近年来增加较快。
(一)AQf)0
AQPo是一种古老的内在蛋白,又称MIP。有水通道作用.
同时对其它离子及小分子也有通过作用,主要在晶状体内皮细
胞表达。【19
(二)AQP1
AQP]是第一个最先发现并被鉴定的水通道蛋白。
r它在组
织中的分布极其广泛,如血液循环系统中的心肌肉、毛细血管、
淋巴管内皮细胞和红细胞等,[ 。
神经系统中的脑脉络丛上皮细
胞,呼吸系统中的肺泡I型细胞、支气管粘膜下腺细胞和气管腔
上皮,l2 消化系统中的胰腺、胆囊、肝管、胆管和结肠隐窝上皮细
胞等,泌尿系统中的肾近曲小管及髓袢降支细段上皮细胞,以及
唾液腺、泪腺和汗腺等腺体上皮细胞和视网膜_2 一等均有水通道
蛋白AQP1的表达。
(三)AQP2
以前认为AQP2仅在肾脏集合管上皮细胞顶质膜表达,但国
内杨军等研究证实,它在人的涎腺中也有表达。[ 一
(四)AQP3
AQP3在肾脏集合管主细胞的基底侧和气管、鼻咽等上皮细
胞有表达l2 ,在消化系统的结肠、肝脏、胰腺和小肠组织中也有
表达。
(五)AQP4
AQP4主要分布在脑和脊髓中,特别是在神经胶质细胞和室
管膜细胞上表达比较强烈,[24 3在其他组织中也有表达,如肾内髓
集合管上皮细胞,支气管、气管的柱状上皮和鼻咽上皮细胞,胃
粘膜层腺细胞等。
(六)AQP5
AQP5位于肺的I型细胞、上气道的分泌上皮细胞,在一些
分泌性细胞中也有表达,如颌下腺、腮腺上皮细胞等。L2
(七)AQP6
AQP6仅分布于肾脏组织中。
(八)AQP7、AQP8、AQP9
AQP7、AQP8、AQP9在消化系统的唾液腺、食管、胃肠道、肝
胆及胰腺有表达。[27 AQP7在肾脏、心脏、骨骼肌和脑组织中有
表达,[28 AQP8、AQP9在肺组织中有表达,但具体定位不清
楚。[28]
五、AQPs的检测方法及发展前景
AQPs是随着生物学和化学技术的发展而发现的。最早A—
gre等利用电泳技术对红细胞Rh抗原蛋白进行分离、纯化时发
现了AQPa,并测定了它的分子量,[ 又利用标记重组、冰冻蚀刻
和形态测量术等方法证实了它们的核酸序列和空间结构,并用
分子克隆技术对AQP1进行了cDNA克隆o[4,6,1oi
现阶段对AQPs的研究方法主要有:
(一)免疫组化
AQP1~AQP5的单克隆抗体已经研究成功,并且商品化,可
以用于定位、半定量研究AQPs蛋白在组织中的表达o[2t-23~该
方法比较成熟,简单易行,研究用组织块条件比较宽松,可用于
常规固定的新鲜组织。该方法可以比较好地检测到细胞膜上的
AQPs,但对细胞内膜性器官上的AQPs定位不理想。
(二)原位杂交
该方法与免疫组化方法类似。免疫组化检{昊4蛋白质,原位
法律与医学杂志2004年第11卷(第1期)
杂交检测它的DNA。现大鼠、兔和人的水通道蛋白核苷酸序列
已经全部测定,可在世界上各大基因库中查到相关的基因序列,
合成核酸探针,进行原位杂交,从而在核酸水平上测定AQPs的
表达和存在。
(三)免疫电镜
可以很好地定位AQPs在细胞结构中的存在,[ 特别是在
细胞浆内膜性器官上的定位,弥补了免疫组化的不足。该法对
组织块的条件要求很高,组织块要新鲜,用锇酸固定,环氧树脂
包埋,并且进行超薄切片,需专业人员进行操作。
(四)RT—PCR
蛋白质的mRNA丰度很小,比且容易降解。RT—PCR可以
成千上万倍地对mRNA进行扩展,通过电泳扩展产物,可以检测
到AQPs的mRNA。
六、AQPs在法医学上的研究
AQPs的发现比较晚,研究现主要集中在临床、生物学和植
物学领域,本文作者还没有检索到相关法医学方面的研究。本
作者认为只少在以下几个方面值得法医工作者进行探讨研究。
(一)基础研究
AQPs在人体组织内广泛存在,人体机能的运转(不论是正
常生理还是异常病理)均与水有关,说明AQPs或多或少都在发
挥积极作用。在法医学研究中,经常遇到与水转运有关的病理
问题,如各种死因导致的肺水肿、脑水肿、皮肤皮革样化以及角
膜浑浊等,特别是一些不明原因的猝死。通过对AQPs的研究,
对阐明这些疑难疾病、现象的机理有所帮助。
(二)应用研究
在法医学实践中,对于一些具体问题的正确鉴定还存在很
大的模糊性和不精确性。如生前溺死与死后抛尸的鉴定、死亡
时间的推定等,现在都是凭大体病理解剖和经验进行推断,科学
性较差。如果借助于AQPs的理论和技术成果进行相关研究,寻
找它们之间的差别,建立相应的数据库,也许在一些问题的解决
方面会有所突破。
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(收稿:2003—01—14;
修回:2003—11—23)