重组人血管内皮抑制素联合FOLFOX方案治疗结肠癌的研究:重组人血管内皮抑素
时间：2019-04-06 03:10:37 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
【摘要】目的 探讨重组人血管内皮抑制素（恩度）联合FOLFOX方案对小鼠结肠癌生长及肝转移的抑制作用。方法 40只小鼠建立结肠癌肝脏转移模型，随机分为对照组，恩度组、FOLFOX组、联合组，每组10只。按照制定的给药方案给药。给药21天观察各组小鼠原发灶的大小，检测原发灶的凋亡指数（AI）、肿瘤微血管密度（MVD）和血清中的VEGF浓度。结果 联合组原位肿瘤与对照组比较，脾脏种植瘤明显缩小（P0.05）。联合组原发灶的AI与对照组相比较，差异有统计学意义（P0.05）。结论 重组人血管内皮抑制素能明显抑制结肠癌的生长。
【关键词】结肠癌；内皮抑制素；血管内皮生长因子
【中图分类号】R7353【文献标识码】A【文章编号】1004-5511（2012）06-0294-02
【Abstract】Objective: To study the inhibitory effect of recombinant human endostatin(endostar) on growth and liver metastasia of colon cancer in mouse. Methods: Colorectal cancer cells were injected into the subcapsule of spleen in mouse to establish a colon cancer liver metastasis model. Forty mouse were divided into 4 groups randomly：control group,endostar-treated group, FOLFOX- treated group, and combination treated group. Injected into the abdominal cavity every day from the next day after surgery. The number of liver metastases, the size of primary tumor were examinde after 3 weeks postoperatively. The expression of apoptotic index(AI) and microvessel dencity(MVD) were examined with immunohistochemistry. The concentrations of VEGF in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Result: The size of spleen implanted tumor in combination treated group was smaller compared with control group(P0.05).The AI of combination treated group was significantly higher than control group(p 1.1 材料(1)实验动物：昆明系小鼠40只（由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2003-0003），雌性，鼠龄4~6周，体重约20 g。(2)细胞株：小鼠结肠腺癌细胞株CT-26由中科院上海细胞所提供。细胞培养在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中， 将细胞置于 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每日换液1次。(3)药物及试剂：血管内皮抑制素（恩度）由山东烟台先声麦得津生物制药有限公司提供。兔抗鼠CD34抗体购自北京中山生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；小鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法 (1) 结肠癌肝转移动物模型的建立：将处于指数生长期的CT-26细胞加入适量生理盐水配成1×107个/ml细胞悬液。4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，打开腹腔，于脾脏下极的包膜下注人CT26细胞悬液0．1 ml，1号丝线间断缝合关腹。40只小鼠随机分为4组，每组10只。腹腔注射给药：对照组（生理盐水），恩度组（恩度8mg/kg,d1-14），FOLFOX组（奥沙利铂10mg/kg，d1；LV50mg/kg，d1-2；5-FU300mg/kg，d1-2）；联合组（恩度8 mg/kg，d1-14；奥沙利铂10mg/kg，d1；LV50mg/kg，d1-2；5-FU300mg/kg，d1-2）。于建模后第2天开始给药，每天给药1次，共21 d。(2) 检测指标与检测方法：①病理观察： 给药后21天眼球摘除法取小鼠外周静脉血标本，常温离心机3000 r/min离心20 min提取血清行ELISA法检测其VEGF浓度。颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔观察脾脏有无癌灶，并记录其大小、数目、体积。肿瘤体积=ab2/2(a:肿瘤最大径，b：肿瘤最小径)。肝脏是否有转移并记录转移灶数目［4］。②凋亡指数（AI）：原位肿瘤标本取下后立即用10%中性甲醛固定4~10 h，梯度酒精系列脱水，石蜡包埋后切片。采用TUNEL法检测细胞凋亡。在400倍高倍视野下，随机选取5个癌区，计算凋亡细胞在全部癌细胞中所占的比例。AI=(凋亡细胞数/癌细胞总数)×100%。③免疫组化： 原位肿瘤经病理切片染色证实后进行肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的检测。MVD的计数参考Weidner等报告的方法进行，即:先用40倍光镜扫视整个切片，寻找高血管密度区，即"热点"。找到"热点"后，在200倍光镜视野下计数5个视野的血管数量。结果用5个200倍视野下的血管数量的平均数做为该切片的微血管密度值［5］。④ELISA法测血清中的VEGF含量：提取的血清，于酶标仪450nm波长处读取吸光度（optical density，OD）值，根据标准品的OD值建立回归方程和绘制标准曲线，再根据各样本的OD值换算出各样本的VEGF浓度。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，原发肿瘤体积、MVD计数、血清VEGF浓度及凋亡指数(AI)比较采用方差分析，肝转移瘤数目采用非参数秩和检验。以P0.05）；恩度组和FOLFOX组比较，差异具有统计学意义（P0.05）；联合组与FOLFOX组比较，差异无统计学。
2．3原位肿瘤的AI 原位肿瘤组织经处理后，镜下均可见有细胞表现为细胞凋亡的形态。4组AI比较差异有统计学意义（F=10.013，P=0.000）。联合组AI与对照组AI比较，差异具有统计学意义（P0.05）；联合组与恩度组、FOLFOX组比较，差异显著（P均>0.05）见表1。
2.4 MVD计数比较 4组MVD计数比较差异有统计学意义 （F=15.736，P=0.000）。联合组、恩度组MVD计数与对照组比较均有明显的减少（P均0.05）。见表1。
2.5 血清VEGF的浓度 4组血清VEGF浓度比较差异有统计学意义（F=12.035，P=0.000）。联合组和恩度组的VEGF浓度均明显低于对照组（P0.05）。见表1。
3 讨论
结肠癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一，其治疗失败的主要原因在于肿瘤的复发和转移［6］。传统治疗方式的有效率已经达到一个瓶颈，这就需要我们寻求新的治疗方法。肿瘤新生血管的形成在肿瘤的生长和转移过程中起很重要的作用，抗血管生成疗法的研究处于当今肿瘤生物靶向治疗领域的前沿。如果没有新生血管的形成，肿瘤的体积将会局限在一个很小的范围内。抑制新生血管的形成可以在一定程度上抑制肿瘤生长和转移，抑制新生血管的形成将成为治疗肿瘤的新模式［7］。
恩度是一种内源性糖蛋白，具有抗血管生成的作用，其主要靶点是正常的血管内皮细胞，血管内皮细胞是正常细胞，变异性小，其迁移、分裂是新生血管形成的主要因素；恩度能够通过抑制血管内皮细胞的迁移和分裂 ，抑制新生血管的形成，阻断肿瘤细胞的营养供给和入血转移的途径，从而达到抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用，同时血管内皮细胞稳定性好，不易耐药［8］。
