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    [DNA甲基化与个体年龄的相关性研究进展]DNA去甲基化

    时间:2020-02-20 10:34:25 来源:柠檬阅读网 本文已影响 柠檬阅读网手机站

    【摘 要】年龄推断在法医实践中占有重要的地位。分子生物学的巨大进展使得人们借助于生物学标记推断个体年
    龄成为可能。作为表观遗传学重要组成部分的DNA甲基化,在机体生长、发育、衰老的过程中存在着动态变化过程.通过
    检测DNA甲基化改变,有望构建与之相关的年龄变化模式,用以推断个体年龄。本文着重介绍DNA甲基化水平的改变与
    个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景。
    【关键词】法医物证;
    DNA甲基化;
    年龄推断;
    生物体衰老
    【中图分类号】D9l9.2
    【文献标识码】A
    【文章编号】1007—9297(2006)04—0284—05
    当前在法医学实践中,对个体年龄的推断主要是
    依据人类学方法测量骨骼、牙齿等一些具有年龄相关
    性的检材.并根据相关模型进行计算。分子生物学的
    飞速发展,开拓了人们的视野。借助于分子生物学理
    论和方法.在细胞水平、分子水平发现一些可能与年
    龄相关的遗传学改变,如DNA损伤修复能力、端粒的
    长度、线粒体片段的缺失、DNA甲基化水平、B一半乳糖
    苷酶活性以及基因表达谱等。lll DNA甲基化是表观遗
    传学(Epigenetics)的重要组成部分,在维持正常细胞
    功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重
    要作用.在衰老的过程中某些细胞会发生年龄相关的
    变化,121例如某个CpG岛的从头甲基化会关闭一个基
    因,使这个基因相关的生理功能丧失:同样。甲基化的
    丢失也会激活正常情况下沉默的基因.造成不恰当的
    异位表达(ectopic expression)。必须指出,表观遗传研
    究丝毫没有降低遗传学或基因组学的重要性,恰恰相
    反,表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基石的经
    典遗传学和分子遗传学母体中孕育的专门研究基因功
    能实现的一种特殊机制的遗传学分支学科。认识到表
    观基因组在发育、生长和衰老过程中存在着一个动态
    变化的过程,以及体细胞的表观基因组有重新编程的
    可能性,有助于我们以新的观点来探索衰老的机制,构
    建年龄变化的模式。本文就DNA甲基化与个体年龄的
    相关性及其在判断个体年龄方面的前景进行探讨。

    、概述
    (一)表观遗传学和DNA甲基化
    遗传学是与表观遗传学(genetic)相对应的概念。
    遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变
    化,如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等;

    表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表
    达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等:表
    观基因组学(epigenomics)~0是在基因组水平上对表观
    遗传学改变的研究。甲基化是最重要的表观遗传修饰
    形式。DNA甲基化是生物体在DNA甲基化转移酶
    (DNMTS)的作用下,以S一腺苷酰一L一甲硫氨酸(SAM)
    为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上去的过程,
    DNA甲基化多发生在胞嘧啶,大多在一CpG一序列上。
    胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine.
    5-mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列。但
    它调控了基因的表达。
    哺乳动物中.CpG序列在基因组中出现的频率仅
    有l%,远低于基因组中的其他核苷酸序列。但在基因
    组的某些区域中,CpG序列密度很高,可以达均值的5
    倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区.形成所谓
    CpG岛。通常CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳
    动物基因组中约有4万个CpG岛,而且只有CpG岛
    的胞嘧啶能够被甲基化,CpG岛通常位于基因的启动
    子区或是第一个外显子区 。人类基因组中大小为
    100~l 000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛总
    是处于未甲基化状态.并且与56%的人类基因组编码
    基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明,人类
    基因组CpG岛约为45 000个.大部分染色体每1 Mb
    就有5—15个CpG岛。平均值为每Mb含lO.5个CpG
    岛,CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。健
    康人基因组中.CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲
    基化状态,而在CpG岛外的CpG位点则通常足甲基化的。这种
    甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。阁基因
    调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5-mC会阻碍
    [作者简介]李鑫(1974一),男,山东淄博人,主检法医师,硕士研究生,主要从事法医遗传学研究。
    法律与医学杂志2006年第l3卷(第4期)
    转录因子复合体与DNA的结合,所以DNA甲基化一
    般与基因沉默(gene silence)相关联;
    而去甲基化
    (demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活(re.
    activation)相关联。当机体衰老或呈病理状态,特别是
    肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲
    基化程度增加,而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化,
    以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。
    一般说来,DNA的甲基化对维持染色体的结构、x染
    色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的
    作用。【6】
    (二)DNA甲基化的生物作用及特点
    1.DNA甲基化与基因表达
    DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚
    胎发育过程以及衰老过程中起着极其重要的作用。研
    究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲
    基化。例如:缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的
    发育都是致死性的。[31此外,等位基因的抑制被印记控
    制区(ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因
    是甲基化的。17]印记基因的异常表达可以引发伴有突
    变和表型缺陷的多种人类疾病。甲基化抑制基因转录
    主要通过以下机制来实现。
    (1)直接抑制。CpG岛甲基化真接干扰TF与调控
    区DNA 的结合. 例如Camp反应元件结合蛋白
    (cREB),Ap一2,E2F,NFKB等TF不能与相应的DNA
    位点相结合。但有些TF如SP1,CTF与甲基化和非甲
    基化位点都能结合,这表明甲基化单独不足以阻止体
    内TF与DNA相结合。
    (2)间接机制。近年来发现一些甲基化DNA结合
    蛋白如MDBP1,MDB2以及甲基化CpG结合蛋白如
    MeCP1,MeCP2与甲基化DNA特异结合,抑制基因转
    录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动
    子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动
    子,但对强的启动子则收效甚微。
    (3)DNA甲基化还可通过影响染色体结构来抑制
    转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起
    始转录,而且MeCP1与甲基化启动子CpG位点结合
    后,可引起染色质聚缩成非活性高级结构,以至于转
    录因子不能与其相结合,从而抑制转录。
    DNA甲基化状态并非固定不变.在许多哺乳动物
    组织内,基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降,
    在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、
    心脏和脾脏内发现DNA脱甲基化作用。相反,大鼠肺
    则不发生脱甲基化,大鼠。肾内甲基脱氧胞苷总含量增
    加。这说明甲基化状态随老化而变化,即发生甲基化
    · 285 ·
    和脱甲基化,但总的说来,最常见的变化似乎是进行
    性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基
    因表达变化。
    2.DNA甲基化与肿瘤的关系
    研究表明,DNA甲基化在肿瘤的发生、发展中起
    重要作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要
    因素,这种变化包括DNA甲基化总体水平降低和启
    动子等基因表达调控元件附近的CpG岛局部甲基化
    水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色
    体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表
    达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的
    等位基因失活,则发生癌症的几率提高,例如:胰岛素
    样生长因子一2(IGF一2)基因印记丢失导致多种肿瘤,
    如Wilm‘S瘤。【8J
    3.DNA甲基化与基因印记
    基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰,这
    种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心
    来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在
    发育全过程中的维持和传递,并导致以亲本来源特异
    性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个.而使另
    一个沉默。基因组印记是可遗传的,DNA的甲基化在
    基因组印记的分子机理中充当重要角色。DNA高甲基
    化是一个基因印记抑制信号,DNA甲基化对控制印记
    基因中父子和母子等位基因的不同表达具有重要作
    用。[91
    4.人类基因组DNA甲基化的特点
    DNA甲基化的基本特征有:1)数量多、信息容量
    大;
    2)可遗传性:有丝分裂时分化细胞可以稳定地将
    甲基化模式传递给子代细胞:3)相对稳定性,即在体
    内.内外环境短时间变化不会引起细胞基因组甲基化
    谱的改变;
    4)与SNP标记毗邻,提供不同层次信息,相
    互补充。人类基因组DNA甲基化还有自身特点。
    (1)时空特异性。DNA甲基化是记录细胞分化历
    史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学
    者认为,DNA甲基化可能使分化细胞基因组重新编
    程,通过DNA 甲基化来控制基因的时空表达,调节发
    育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞
    的不同发育阶段,基因组DNA上各CpG位点甲基化
    状态的差异构成基因组DNA甲基化谱。组织特异的
    DNA甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。
    细胞之间DNA甲基化模式的差异是在个体发育
    的过程中逐步形成的,并在以后的有丝分裂中保持不
    变。在胚胎发育过程中,细胞的甲基化模式按一定方向
    发生有规律地变化。成年个体,组织特异性基因形成组
    · 286 ·
    织特异性的甲基化模式。随着年龄增长,基因组DNA甲
    基化总体水平不断下降.特定DNA片断的甲基化程度
    可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。
    (2)亲缘特异性。在某些基因座,所有组织体细胞
    都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化.呈现亲缘
    依赖的等位基因甲基化模式。
    (3)病理特异性。在病理状态下,组织细胞的DNA
    甲基化谱发生特异性的改变。DNA甲基化改变在许多
    肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实,启
    动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。
    二、DNA甲基化与年龄相关性
    分化细胞的稳定性是高等生物的基本特征之一。
    然而,在衰老过程中某些细胞会发生年龄相关的变
    化。例如,某种CpG岛的从头甲基化会关闭一个基因,
    丧失与这个基因相关的生理功能;
    同样.甲基化的丧
    失也会激活正常情况下沉默的基因,造成不恰当的异
    位表达。2O世纪8O年代初,Wilson等测定了体外培养
    的人、田鼠及小鼠成纤维细胞DNA的5 甲基胞嘧啶
    含量,发现均随细胞分裂次数的增加而降低.且下降
    速度以人、田鼠、小鼠的次序递减.而永生化细胞系的
    5 甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以DNA甲基化
    酶抑制剂5 氮杂胞苷或5 氮脱氧胞苷处理人二倍
    体成纤维细胞或某些肿瘤细胞,可使其增殖能力下
    降,体外培养寿限缩短。因此,DNA甲基化水平也可以
    作为细胞分裂的“计时器”。体内实验同样发现基因组
    整体甲基化水平有随龄降低的趋势。
    在基因组整体甲基化水平降低的同时,衰老过程
    中也伴有个别基因甲基化水平增高的现象。最早证明
    与年龄相关启动子CpG岛的甲基化是人结肠组织雌
    激素受体(estrogen receptor,ER)基因,年轻个体中,几
    乎检测不到ER基因的甲基化,以后,随龄逐渐升高。
    另外。胰岛索样生长因子2(insulinlike growth facror,
    IGF2)、肌原调节蛋白MYOD1、体觉诱发电位组分
    N33基因启动子CpG岛的甲基化水平在正常的结肠
    组织中同样随龄升高。Tra等用限制性界标基因组扫
    描技术对T淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变
    化情况进行了调查,发现29个基因座有变化,其中23
    个增加,6个降低。也许.这些特定基因的甲基化是更
    好的衰老生物学标志。
    陈培利等_10]利用人胚肺二倍体成纤维细胞(hu
    man fetal lung diploid fibroblasts。2BS)进行体外培养。
    发现其p16基因启动子区及外显子I处的DNA甲基
    化水平随个体细胞代龄的增加而降低。他们首先将
    2BS细胞在体外作常规传代培养(规定3O代龄以内为
    法律与医学杂志2006年第l3卷(第4期)
    年轻细胞,55代龄以上为衰老细胞,在31至54代龄
    之问位中年细胞)。然后用有机法提取细胞DNA,取各
    组DNA各llxg加入Sinai约40U,25~C酶切过夜(Smai
    不具备甲基化修饰作用)。然后对p16基因外显子I
    及13-actin进行PCR扩增。
    ll 二| ’。_ lll
    l | _ __⋯一_l\
    ‘l \_ _l" _lI \
    _l\ Il 、
    l i、
    4 _ lI 0_ _l
    年轻细胞中年j田胞老年细胞
    围1不同代龄2BS细胞p16外显于PCR扩增条带的吸光度扫描值【’。
    寰1 不同代龄2BS细胞pl6外丑于l殛I~-actinPCR扩增条带的吸
    光度扫描值
    组别 n
    沣:#以B—actin的值校正后结果;
    t检验,与年轻细胞相比, p<O.05
    实验结果(参见表1)表明,不同代龄2BS细胞
    p16基因外显子I上的扩增产物均低于相对的未酶切
    的B—actin对照组,且其DNA甲基化水平随代龄的增
    加而趋于降低,在年轻细胞中甲基化水平约为64%.
    而在衰老细胞中仅为24%,降低约40%。在之后的研
    究中,陈培利等在以2BS为模型的衰老研究中发现,
    细胞分裂一次端区(即端粒)缩短50bp,抑制DNA甲
    基化则可导致细胞早衰。⋯】他们测定了去甲基化处理
    后的2BS细胞的端区长度.研究表明老年2BS细胞衰
    老表型更加明显,端区长度较对照细胞缩短,而年轻
    细胞则变化不显著。从而推断甲基化的改变可以影响
    染色质的构象,从而可能改变端区结合蛋白与DNA
    的作用l1 1,后者可以进一步引起端区长度改变。
    三、DNA 甲基化检测方法
    随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化
    检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。
    DNA甲基化可以从甲基化含量、甲基化水平、甲基化
    模式和甲基化图谱分析等多种途径进行分析。甲基化
    含量分析5mC在基因组中所占的总体比例:甲基化水
    2 1 8 6 4 2 0
    L n n
    璎辍 越
    法律与医学杂志2006年第13卷(第4期)
    平分析单个CpG胞嘧啶甲基化的发生率,若同时分析
    多个CpG位点,则可以制作甲基化水平图谱;
    甲基化模
    式分析一段单链DNA上一组CpG的甲基化状态组合。
    根据研究目的,甲基化检测方法分为:基因组整体水平
    的甲基化检测,特异位点甲基化的检测和寻找新甲基化
    位点。从研究所用的处理方法不同分为:基于PCR的甲
    基化分析方法;
    基于限制性内切酶的甲基化分析方法;

    基于重亚硫酸盐的分析方法和层析法等。[31以下归纳
    总结了主要的甲基化分析方法以及相关特性。
    (一)基因组整体水平甲基化分析
    高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法。HPLC是一
    种比较传统的方法,能够定量测定基因组整体水平
    DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年[131首次报道。
    过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基,
    水解产物通过色谱柱,结果与标准品比较,用紫外光
    测定吸收峰值及其量,计算5mC/(5mC+5C)的积分面
    积就得到基因组整体的甲基化水平。Oefner等1992
    年提出变性高效液相色谱法(DHPLC)用于分析单核
    苷酸和DNA分子。邓大君等2001年I141将其改进与
    PCR联用建:立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析
    方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增。
    由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞
    嘧啶,因此原甲基化的在PCR扩增时,其变性温度也
    相应上升。使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延
    长.这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。
    这种方法的最明显优点是:可用于高通量混合样
    本检测.能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基
    化的情况.但不能对甲基化的CpG位点进行定位。
    其他基因组水平甲基化分析还有SssI甲基转移
    酶法,免疫化学法,氯乙醛法等。各具优缺点。
    (二)特异性位点的DNA 甲基化的检测
    1.甲基化敏感性限制性内切酶(MS—RE—PCR/
    Southern)法
    这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲
    基化区的不切割的特性.将DNA消化为不同大小的
    片段后再进行分析。

    这是一种经典的甲基化研究方
    法,其优点是:相对简单,成本低廉,甲基化位点明确,
    实验结果易解释;

    2.甲基化特异性的PCR(MS—PCR)
    Herman等[161 1996年在使用重亚硫酸盐处理的基
    础上新建的一种方法。它将DNA先用重亚硫酸盐处
    理。这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化
    的不变。随后行引物特异性的PCR。检测MSP扩增产
    物.如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增
    · 287 ·
    出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;
    若用针对
    处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段.则说明
    被检测的位点不存在甲基化(见图2)。[15·17]
    . /
    5’衄_{2盈__ 平 盈3. 5-啪__曩墨|_唧H _霉叠__甲3·
    — __. —
    p1.m rI 一 一
    图2甲基特异性的PCR扩增(MS—PCR)示意I莩I。DNA经重亚硫酸盐处
    理后。以处理后的产物作为模板.加入甲基化特异性的引物(primer 1)
    或非甲基化的引物(primer¨).进行特异性的扩增(如图所示),只有结
    合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。[1s,1
    (三)寻找新甲基化位点
    1.限制性标记基因组扫描(RLGS)
    Costello等2000年报道的RLGS[ 81能对整个基因
    组的甲基化状态进行分析.发现新甲基化基因的方
    法。这种方法联合使用了限制性内切酶及二维电泳。
    其过程是:先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶Not
    I消化基因组DNA,甲基化位点保留,标记末端、切
    割、行一维电泳,随后再用更高频的甲基化不敏感的
    内切酶切割。行二维电泳,这样甲基化的部分被切割
    开并在电泳时显带,得到RLGS图谱与正常对照得出
    缺失条带即为甲基化的可能部位。
    2.联合甲基化敏感性限制性内切酶的MB(COM.
    PARE—MS)
    Srinivasan Yegnasubramaniant 91 2006年报道了一
    种新方法COMPARE—MS.该法将MBD柱层析法与
    MS—RE联用。互补了各自单用的弊处,能够快速、敏感
    的检测DNA甲基化情况(见图3)。[19J
    四、甲基化型分析的优势以及存在的问题
    (一)甲基化作为检测对象的优势
    1.甲基化型既能反映有关基因功能状态及与此相
    连的多种疾病相关的丰富信息。叉具有简单的“二元
    化”性质,即令甲基化为“0”,非甲基化为“1”,就可以进
    行数字化处理,便于开展大规模和自动化监测分析。
    2.DNA分子十分稳定。有可能将它和DNA的SNP
    分析等置于同一个技术平台。同时它又比RNA和蛋白
    质更便于保存和运输。并可对已经石蜡、甲醛或乙醇预
    · 288 ·
    _F 簟
    ● ●
    图3 联台甲基化敏豫性限制性内切酶的MBD (COMPARE-MS)示
    意围。用甲基化以外的位点的内切酶IA酶)与甲基化敏雅的内切酶(B
    酶)联用.则甲基化的DNA链不被切开。非甲基化的切开.再行MBD
    捕获存在甲基化位点的DNA片段。最后行实时PCR扩增并分析。f删
    处理的样本进行分析,可以开发历史上储备的病理学资
    料。
    (二)存在的问题
    目前还未找到DNA甲基化改变与年龄之间的精
    确的量化关系式。虽然人们对个体细胞的衰老及其基
    因甲基化水平的改变有了初步的了解.但还在研究探
    索二者之问的精确的量化关系。[201对使用DNA甲基
    化改变来推断个体年龄的大小,仍需要进行大量的研
    究和调查。
    (三)付诸于实践之前还必须解决的问题
    1.确定表观遗传修饰与特定生理指标的相关性:
    2证实将这些指标作为鉴别诊断的潜在可能性和
    技术可行性:
    3.通过一定规模的流行病学调查来验证实验室内
    的表观遗传生理及病理发现在人群中的真实性。
    五、DNA甲基化在法医学中判定个体年龄上的展

    目前,研究DNA甲基化水平改变与个体年龄的
    相关性尚处于试验阶段,但已引起许多学者的关注。
    人类表观基因组协会(Human Epigenome Con—sortium,
    HEC)于2003年1O月正式宣布开始投资和实施人类
    表观基因组计划(Human Epigenome Project,HEP)。
    DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的
    重要研究内容,HEP的最终目标是就要确认这些DNA
    甲基化位点在人类基因组的分布与频率,以指导和系
    统研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因
    印记等发挥的作用。

    借助于该计划的实施和分子生
    物学技术的发展,在法医实践中可以通过调查各年龄
    段人群基因组DNA甲基化分布以及相关频率,建立
    相关统计学模型,将来有望成为法医个体年龄判定的
    一项重要的生物学指标。(感谢西安交通大学医学院第一附
    法律与医学杂志2006年第l3卷(第4期)
    属医院妇产科、环境与疾病相关教育部重点实验室郑鹏生教授
    和顾婷婷同学的支持和帮助。)
    参考文献
    【1 J 马宏,张宗玉,童坦君.衰老的生物学标志[J】.生理科学进展,2002,
    33:65—69
    [2】陈朝飞,房静远.衰老的表观遗传修饰研究[J】.上海医学,2006,29
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    (收稿:2006—06—02;
    修回:2006—09—12)

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