[DNA检测技术在天然动物纤维鉴别中的应用]45阳DNA阴有肝纤维吗

时间：2019-05-17 03:29:19　来源：柠檬阅读网本文已影响人

　　自1985年PCR技术诞生起，各种基于DNA技术的研究应用也如火如荼地展开。随着生物技术和生命科学的飞速发展，DNA检测技术以其客观性和精准性在食品、动植物检疫、医疗诊断、司法鉴定及环境监测等领域得到了广泛的应用。
　　
　　1 DNA检测技术简介
　　DNA是细胞中编码遗传信息的脱氧核糖核酸。每个物种都有其特异的DNA组成，形成了五彩缤纷的生物界。当前，一项称为“国际生命条形码（International Barcode of Life）”计划正在欧美等国展开，就是利用DNA序列对物种进行鉴定，为生物分类学和多样性的研究提供有力手段。我国也加入到研究全球生命条码计划，而且是全球的一个中心节点。人与人之间有99.9%的DNA是相同的，恰恰是这0.1%的差异，造就了不同肤色，不同容貌的一个个特定的个体。DNA检测就是利用遗传学、分子生物学技术对目的DNA进行检测，在分析判断的过程中，其对象可以是特定的片段，也可以是DNA的序列。
　　DNA在细胞中的含量是微少的，所有的检测技术都离不开体外的模拟复制，即扩增的过程。1985年出现的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），即PCR技术，因其扩增的高效性，有如核裂变式的“链式反应”而得名，可以说是现代生物技术的基石，许多伟大的技术都是基于PCR技术，或对其进行改进而发挥作用的。PCR是一种简化了的模拟体内DNA复制的酶促反应，微量的DNA模板，经过若干个变性、退火、延伸的循环过程特异扩增位于两段引物以内的DNA片段，短短 2 ～ 3 h就能将目的基因扩增放大为上亿倍。借助电泳、测序等PCR产物检测手段，就能一探感兴趣的DNA的究竟。
　　DNA测序，是指对核苷酸的排列顺序进行破解，即A、T、G、C排列顺序的测定。这一技术在司法鉴定、医学研究及医学诊断领域用得比较多。
　　荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，在实现更高精确度定性的同时，还能实现对未知DNA模板进行定量或是通过比较参照物进行相对定量的技术。该技术采用闭管检测分析法，采用无干扰的荧光激发光源，不需电泳等PCR后处理，操作方便，耗时短，且能对整个过程的荧光信号进行监测，进行精确、特异的检测，是目前基因检测领域使用得比较广泛的技术。
　　
　　2 DNA检测技术在特种动物纤维定性分析中的研
　　究进展
　　动物纤维的DNA检测技术起步较晚，究其原因主要是从毛发中分离出DNA比较困难。上个世纪80年代，随着科研人员尝试，成功从动物毛发中分离出DNA，DNA检测技术首次被引入毛发检测领域，开创了动物纤维DNA检测的先河。Jochen Kalbe等人不但成功使用酚氯仿法从人类毛发中分离出高分子量的基因组DNA，也将该方法成功运用到羊驼、安哥拉兔、安哥拉山羊、山羊、美丽诺绵羊、牦牛等纤维DNA的抽提，为分子生物学鉴定生物物种提供了可能。
　　高质量的DNA是实现DNA检测的第一步。早期毛发DNA的抽提技术的改进得益于司法鉴定的需要。传统的酚氯仿抽提方法，成本较低，在很长一段时间内是毛发DNA抽提的主要途径，但酚氯法抽提法存在一个缺陷，可溶于水相的PCR抑制物，如色素、染料等会抑制后续的PCR检测。目前关于动物毛发的DNA提取技术获得了长足的发展，各类抽提试剂盒也纷纷问世。K.Takayanagi等人将人体毛发作为研究对象，比较了酚氯仿抽提法、NaI处理法和有机硅磁珠抽提法等 3 种方法，并采用FAM标记的引物扩增线粒体调控区的某一区域作为DNA抽提效率和质量的评价手段。该研究比较了 3 种方法抽提不同长度毛发，以及不同的模板DNA投入量对荧光强度的影响，得出 3 种方法并无很大差异的结论。但在抽提一个放置了11年的毛发样品时，NaI处理法和有机硅磁珠抽提法能检测到足够强的荧光信号，而酚氯仿抽提法处理的DNA无法检测到。这表明，NaI处理法和有机硅磁珠抽提法在处理久放降解的样本时，要优于传统的酚氯法抽提法。3 种方法中，有机硅磁珠抽提法以其操作简便、处理时间短而胜出。
　　羊毛与羊绒因组织结构、外观形态、理化性质相似长期以来一直是纺织检测的一个难题，目前常规使用的检测方法为物理法，主要包括光学显微镜法和扫描电镜法（SEM）。传统的显微镜法主要依赖于羊毛和羊绒的表观性质，实际操作费时费力，很大程序上依赖于检测人员的经验，且羊毛和羊绒的直径、表面鳞片高度及鳞片厚度等本身存在一定的交叉，加之越来越先进的造假技术，单独以某项性质作为判别指标难免会降低检测的准确度。因而羊毛羊绒的鉴别成了DNA检测技术在天然动物纤维鉴别方面应用的典型事例，很多研究都是从羊毛、羊绒的鉴别开始的。
　　美国科学家Nelson等人于1992年设计了物种特异的绵羊探针进行点杂交实验，该探针不会与羊绒、马海毛的DNA发生互补配对，从而可以成功地区分羊毛与其他纤维，但此方法鉴于当时的生物技术水平，仍存在诸多缺点，没能推广到实际应用中去。直到2004年，印度科学家Subramanian等人利用绵羊与山羊核酸序列多态性，运用PCR-RFLP技术成功建立了羊毛和羊绒的鉴别方法。该方法的巧妙之处是利用了线粒体基因组的多拷贝数和高进化性，成功地解决了纤维基因组DNA量少，难以抽提的难题，不足之处在于PCR-RFLP分析较为烦琐，且无法精确定量。而Kirsten等人于2009年，在上述基础上进行了改进，仅利用短片段物种特异性PCR来区分羊毛、羊绒、骆驼毛、牦牛毛等纤维，实现了快速简便的纤维定性分析，Kirsten等人还系统地对动物纤维的DNA提取工艺进行了深入的研究，比较了动物纤维的清洗、漂白和染色等 3 道基本工序对DNA抽提的影响，研究发生每增加一道加工工序DNA的提取得率就会明显降低，其中尤以染色环节对DNA的破坏最显著。
　　
　　3 DNA检测技术在特种动物纤维定量分析中的研
　　究进展
　　日本纺织检查协会（JSIF）率先开展了利用DNA分析法对动物纤维混合比例的定量研究，设计了针对山羊、绵羊和牦牛的Taqman探针，建立了羊毛/羊绒二组分混合纤维及羊毛/羊绒/牦牛毛 3 组分混合纤维的相对定量方法。该方法巧妙地避开了绝对定量难的问题，减少了DNA抽提效率对定量分析的影响。
　　另一工作小组，计皖博士等人从最基础的荧光定量PCR的数学原理出发，设计了针对山羊、绵羊的Taqman探针引物，通过实验验证了两对探针引物的效率近似相等，简化了定量的计算，实现了通过检测混合物的 2 个Ct值就可以计算出羊毛、羊绒的混合比率。通过对中国纤检局提供的盲样的测试，误差可以控制在10%以内。这一研究成果给羊毛、羊绒定量检测提供了新的思路，极大地推进了纺织品质量检测现代化技术的发展。
　　
　　4 难点与展望
　　DNA检测技术依靠的是物种特异的DNA序列，不受检测人员经验的限制，结果更为客观、精确，因而利用DNA检测技术对天然动物纤维进行定性定量有着广泛的应用前景。
　　目前制约该检测技术在天然动物纤维中的发展主要有两大因素：一是天然植物纤维中所含的色素会抑制PCR的进行；二是纤维的某些染整环节会对其DNA长链结构造成破坏，从而抑制PCR的进行。解决了这些问题，DNA检测技术必将在天然纺织纤维检测领域有更大的应用空间。
　　

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